Induction d'une torpeur

Nature Metabolism volume 5, pages 789–803 (2023)Citer cet article

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La torpeur est un état d'économie d'énergie dans lequel les animaux diminuent considérablement leur taux métabolique et leur température corporelle pour survivre à des conditions environnementales difficiles. Nous rapportons ici l'induction non invasive, précise et sûre d'un état hypothermique et hypométabolique de type torpeur chez les rongeurs par stimulation ultrasonore transcrânienne à distance au niveau de la zone préoptique de l'hypothalamus (POA). Nous obtenons un état de torpeur de longue durée (> 24 h) chez la souris via un contrôle de rétroaction en boucle fermée de la stimulation par ultrasons avec détection automatisée de la température corporelle. L'hypothermie et l'hypométabolisme induits par les ultrasons (UIH) sont déclenchés par l'activation des neurones POA, impliquent l'hypothalamus dorsomédian en tant que région cérébrale en aval et l'inhibition ultérieure du tissu adipeux brun thermogénique. Le séquençage de l'ARN à noyau unique des neurones POA révèle que TRPM2 est un canal ionique sensible aux ultrasons, dont l'inactivation supprime l'UIH. Nous démontrons également que l'UIH est réalisable chez un animal non torpide, le rat. Nos résultats établissent l'UIH comme une technologie prometteuse pour l'induction non invasive et sûre d'un état de torpeur.

La torpeur, comme l'hibernation, est un état physiologique dans lequel les mammifères suppriment activement le métabolisme, réduisent la température corporelle et ralentissent d'autres processus vivants pour conserver l'énergie et survivre à des conditions mortelles et à des températures environnementales froides1. Le concept d'induction d'hypothermie et d'hypométabolisme de type torpeur par des moyens artificiels a été initialement proposé en 1960 comme solution biomédicale pour réduire la consommation d'énergie pendant les vols spatiaux humains de longue durée2,3. L'hypothermie et l'hypométabolisme de type torpeur pourraient également augmenter la probabilité de survie des patients dans des conditions potentiellement mortelles (par exemple, crise cardiaque ou accident vasculaire cérébral) en ralentissant le métabolisme et la progression de la maladie4.

L'induction non invasive et sûre d'un état semblable à la torpeur a été considérée comme de la science-fiction confinée aux films et aux romans5,6. Malgré plusieurs décennies de recherche, il n'a toujours pas été atteint. Le concept original proposait que l'hibernation soit régulée par des substances sanguines endogènes7 et des efforts considérables ont été consacrés à la recherche de substances endogènes qui induisent un état semblable à la torpeur en supprimant systématiquement le métabolisme8,9. On pense maintenant que la torpeur est contrôlée par le système nerveux central (SNC) pour coordonner avec précision de nombreuses fonctions10,11,12. Il a été rapporté que l'injection intracrânienne directe d'agents pharmaceutiques ciblant les voies du SNC induisait un état d'hypothermie profonde ressemblant à une torpeur naturelle13,14. Des études révolutionnaires récentes ont identifié plusieurs populations neuronales dans le POA hypothalamique qui régulent la torpeur et l'hibernation chez les rongeurs11,12,15. Le génie génétique de ces populations neuronales pour la manipulation optogénétique et chimiogénétique a obtenu des caractéristiques comportementales et physiologiques critiques de torpeur/hibernation chez la souris11,12,15. Bien que ces avancées technologiques dans l'induction d'un état de type torpeur soient prometteuses, ces approches nécessitent une intervention chirurgicale ou un génie génétique, limitant la large application de ces approches et leur traduction chez l'homme.

L'échographie est la seule forme d'énergie disponible qui peut pénétrer de manière non invasive dans le crâne et se concentrer sur n'importe quel endroit du cerveau avec une précision millimétrique et sans rayonnement ionisant16,17. Ces capacités, ainsi que sa sécurité, sa portabilité et son faible coût, ont fait des ultrasons une technologie prometteuse pour la neuromodulation chez les petits animaux18,19, les primates non humains20,21 et les humains16,22, bien que son mécanisme reste insaisissable. Nous rapportons ici l'induction non invasive, précise et sûre d'un état de type torpeur chez la souris par stimulation ultrasonore à distance au niveau du POA (Fig. 1a). Nous avons découvert que cette UIH était associée à l'activation ultrasonique du canal ionique TRPM2 exprimé dans les neurones POA associés à la torpeur. Nous avons découvert l'implication potentielle de l'hypothalamus dorsomédian en tant que région cérébrale en aval et du tissu adipeux brun en tant que tissu effecteur dans la régulation de l'UIH. Nous avons également démontré que la stimulation par ultrasons au POA induit avec succès l'hypothermie chez le rat, un animal non torpide.

a, Illustration de l'état de torpeur induit par les ultrasons (US). b, Illustration de la sonde US portable (en haut). La sonde était branchée sur une plaque de base qui était collée sur la tête de la souris. L'IRM de la tête de la souris avec la sonde US portable montre que l'échographie a été ciblée de manière non invasive sur le POA (insert). La photographie d'une souris se déplaçant librement avec la sonde US portable attachée est montrée en bas. c, Illustration de la forme d'onde de stimulation américaine utilisée dans cette étude. ISI, intervalle inter-stimulus ; PD, durée d'impulsion ; PRF, fréquence de répétition des impulsions. d, Etalonnage de la montée en température (T) en surface (en haut) et à l'intérieur (en bas) de la sonde US. La température à l'intérieur de la sonde a été mesurée entre le matériau piézoélectrique et la tête de la souris lorsque les sondes américaines visaient le POA ou le cortex. Cortex a été sélectionné comme contrôle hors cible. La sonication US est indiquée par les barres roses. n = 6 souris (en haut) et n = 4 souris (en bas). Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem

Données source

La torpeur naturelle est caractérisée par des caractéristiques clés d'hypothermie, d'hypométabolisme et d'hypoactivité11,23. Nous avons conçu un transducteur à ultrasons portable "plug-and-play" (Fig. 1b et Extended Data Fig. 1) pour fournir à distance des ultrasons à la région POA de souris en mouvement libre qui avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Nous avons d'abord enregistré le changement de température corporelle de la souris par une caméra infrarouge thermique et avons constaté une diminution profonde de la température de la peau dans la zone interscapulaire où réside le tissu adipeux brun (BAT) (TBAT) (Fig. 2a et vidéo supplémentaire 1), pendant et après la stimulation par ultrasons (1,6 MPa en pression acoustique 3,2 MHz en fréquence, 50 ms en durée d'impulsion, 10 Hz en fréquence de répétition des impulsions, 10 s en durée de stimulation, 30 s en intervalle inter-stimulus et 6 en nombre total de stimuli ; figure 1c). Cette observation d'une diminution de la température de BAT a été synchronisée avec une augmentation de la température de la queue (Fig. 2a, b). Les deux principaux mécanismes sous-jacents à la thermorégulation chez les rongeurs sont la thermogenèse BAT (qui permet la production de chaleur sans frissons) et la vasodilatation de la queue (qui permet la dissipation de la chaleur). Ces résultats ont indiqué que la stimulation par ultrasons de la POA chez la souris supprimait la production de chaleur et initiait la perte de chaleur pour induire l'hypothermie. Des enregistrements vidéo du comportement animal ont montré que la stimulation ultrasonore du POA était également corrélée à une réduction de l'activité locomotrice (Fig. 2b).

a, images thermiques infrarouges (en haut) et photos (en bas) d'une souris recevant une stimulation US à POA. La sonde du transducteur US est marquée par des cercles en pointillés. b, température BAT (TBAT), température de la queue (Ttail) et activité physique des souris avec stimulation US à POA (US+, n = 12 souris) par rapport à deux groupes témoins : souris sans sonication US (US–, n = 12 souris) et souris avec stimulation US au niveau du cortex comme contrôle hors cible (hors cible, n = 6 souris). La sonication US est indiquée par les barres roses. c, Température corporelle centrale (Tcore), taux métabolique (VO2) et QR (VCO2/VO2) pour les groupes US+ (n = 13 souris pour Tcore et n = 17 souris pour VO2 et RQ), US– (n = 14 souris pour Tcore et n = 18 souris pour VO2 et RQ) et groupes hors cible (n = 4 souris pour Tcore, VO2 et RQ) (en haut, de gauche à droite). ΔTcore max (Tcore le plus bas - Tcore moyen avant US), ΔVO2 max (VO2 le plus bas - VO2 moyen avant US) et ΔRQ max (QR le plus bas - QR moyen avant US) (en bas, de gauche à droite). Les souris mâles et femelles sont représentées respectivement par des points bleus et roses. d, Traces ECG représentatives chez la souris avant (en haut) et après la stimulation américaine (en bas). e, Fréquence cardiaque avant et après stimulation US pour les groupes US+ (n = 9 souris), US– (n = 5 souris) et hors cible (n = 5 souris, ciblant l'hippocampe) (à gauche). Aucune différence significative n'a été constatée entre le groupe hors cible et le groupe américain pendant toute la durée de l'enregistrement. Comparaison de la fréquence cardiaque avant la stimulation US et de la fréquence cardiaque la plus basse obtenue par stimulation US au POA dans les 10 minutes suivant la stimulation US (à droite). bpm, battements par minute. Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle suivie du test post hoc de Dunnett en c et e (à gauche) comparant les groupes US+ et hors cible au groupe US–, respectivement, et d'un test t bilatéral apparié en e (à droite).

Données source

Nous avons ensuite placé des souris dans des cages métaboliques, ce qui nous a permis d'évaluer leur métabolisme avant, pendant et après la stimulation ultrasonore du POA en analysant les taux de consommation d'oxygène (VO2) et le quotient respiratoire (RQ = VCO2 / VO2)12. Ces souris ont été implantées avec des capteurs de température sans fil dans leur cavité abdominale pour mesurer simultanément la température corporelle centrale (Tcore). La stimulation par ultrasons a entraîné une diminution marquée de la température corporelle centrale (max ∆Tcore = −3,26 ± 0,19 °C) (Fig. 2c) et de la VO2 (de 36,61 ± 1,74 %) (Fig. 2c). Ces tailles d'effet étaient similaires à la torpeur induite par le jeûne précédemment rapportée chez la souris11,24. L'échographie a supprimé la consommation d'oxygène avant la chute de la température corporelle (données étendues Fig. 2b, c), suggérant une inhibition active du métabolisme plutôt qu'un effet secondaire de l'hypothermie. La durée de la réduction de Tcore en dessous de la température corporelle était de 51,98 ± 5,52 min par UIH (Extended Data Fig. 2d), ce qui était comparable à la torpeur naturelle24,25. L'échographie a également diminué le QR à 0,72 ± 0,01 (Fig. 2c). Un QR proche de 0,7 indique que l'UIH a fait passer l'utilisation du substrat énergétique d'un mélange de glucides et de graisses à une dépendance à l'oxydation des graisses, qui a été établie comme une caractéristique commune des animaux torpides26. Les souris subissant une UIH sont spontanément passées de l'état hypothermique et hypométabolique à un état normal, qui est également une caractéristique essentielle de la torpeur naturelle5,11,12. Les enregistrements d'électrocardiogramme (ECG) ont montré que l'UIH diminuait la fréquence cardiaque de 47, 3%, ce qui était significativement inférieur à celui avant la stimulation par ultrasons et le groupe sans stimulation par ultrasons (Fig. 2d, e). Ces états physiologiques n'ont pas été observés chez les souris sans stimulation par ultrasons ou avec stimulation par ultrasons à des endroits non ciblés (cortex et hippocampe ventral) (Fig. 2b – e et Extended Data Fig. 3), vérifiant que l'état de torpeur induit par les ultrasons était évoqué par une stimulation spécifique à la POA, au lieu d'effets non spécifiques, tels que la chaleur produite par un matériau piézoélectrique à ultrasons (Fig. 1d). L'examen immunohistologique des cerveaux de souris après traitement par ultrasons n'a révélé aucun dommage ou inflammation visible dans le cerveau (données étendues, Fig. 4). Toutes les expériences ci-dessus ont été réalisées à température ambiante (~ 22 ° C). Nous avons répété l'expérience à une température ambiante froide (6 ° C) et thermoneutre (30 ° C) et avons constaté que l'hypothermie et l'hypométabolisme étaient évoqués avec succès (Extended Data Fig. 5). La taille de l'effet de l'UIH augmentait à mesure que la température ambiante diminuait (données étendues Fig. 5), ce qui suggère que l'effet de l'UIH pourrait être modulé par la température ambiante.

Nous avons ensuite étudié la capacité des ultrasons à contrôler avec précision la profondeur et la durée de l'hypothermie. Cette capacité à contrôler avec précision l'état induit est la clé du succès de l'ingénierie de l'état de torpeur. L'effet des ultrasons sur le cerveau dépend de nombreux paramètres, dont la pression acoustique et la durée du stimulus. Nous avons observé qu'une pression acoustique et une durée de stimulus plus élevées augmentaient la profondeur de l'UIH, telle que mesurée par max ∆TBAT (Fig. 3a, b). Une pression acoustique supérieure à 0,8 MPa était nécessaire pour provoquer un changement significatif de ∆TBAT dans l'espace des paramètres testé dans cette étude. Nous avons développé un contrôleur de rétroaction automatique en boucle fermée pour obtenir une UIH stable et de longue durée par contrôle binaire de la sortie ultrasonore. Comme preuve de concept, le contrôleur de rétroaction en boucle fermée a défini la température corporelle souhaitée (Tset) à une valeur inférieure à 34 ° C, ce qui était précédemment signalé comme critère de torpeur naturelle chez la souris (Fig. 3c). Le contrôleur a reçu en continu des signaux d'entrée du capteur de température corporelle centrale, puis a activé la stimulation par ultrasons lorsque Tcore > Tset ou désactivé lorsque Tcore ≤ Tset. La température corporelle centrale a été enregistrée pendant une durée totale de 30 h et la procédure d'échographie contrôlée par rétroaction s'est poursuivie pendant 24 h. Les résultats ont montré que l'UIH contrôlée par rétroaction maintenait la température corporelle de la souris à 32, 95 ± 0, 45 ° C pendant environ 24 h (24, 90 ± 0, 63 h) (Fig. 3d, e). Les souris ont montré une réduction de l'apport alimentaire et de la perte de poids avec l'UIH contrôlée par rétroaction par rapport aux témoins (Fig. 3f). La température corporelle de la souris est progressivement revenue à un niveau normal (> 34 ° C) à 54, 18 ± 35, 56 min après la fin de l'UIH contrôlée par rétroaction (Extended Data Fig. 2e). Le système de contrôle de rétroaction en boucle fermée révèle le grand potentiel de la technologie d'interface ultrasons-cerveau pour l'induction non invasive et précise de l'UIH.

a, TBAT mesuré avec une stimulation US à différentes pressions acoustiques (à gauche) et durées de stimulation (à droite). Les lignes pleines et les ombres dans les courbes indiquent la moyenne ± sem b, Corrélations entre ΔTBAT max (TBAT le plus bas - TBAT moyen avant US) et la pression acoustique (à gauche) ou la durée du stimulus (à droite). n = 4 souris pour les groupes 0,4-MPa, 1,2-MPa, 2-s, 4-s et 6-s ; n = 7 pour les groupes 0-MPa et 0-s ; n = 3 pour les groupes 0,8-MPa et 8-s et n = 6 pour les groupes 1,6 MPa et 10-s). Les barres d'erreur indiquent sem c, Illustration schématique du système de contrôle de rétroaction en boucle fermée pour obtenir une UIH de longue durée (créé avec BioRender.com). d, Tcore représentatif mesuré chez une souris avec l'UIH à rétroaction en boucle fermée. Chaque stimulus américain est représenté par un point rose. e, Quantification du Tcore moyen (à gauche) et de la durée lorsque Tcore < 34 °C (à droite) atteint par le système de contrôle de rétroaction en boucle fermée. f, apport alimentaire (à gauche) et changement de poids corporel (à droite) des souris ayant subi une UIH contrôlée par rétroaction en boucle fermée (US +, n = 4 souris), par rapport aux souris témoins (US-, n = 4 souris). Pour les boîtes à moustaches, la ligne centrale et les limites de la boîte indiquent que les valeurs moyennes ± sem P ont été calculées à l'aide d'un test t non apparié à deux queues.

Données source

Pour comprendre le mécanisme neuronal de l'UIH, nous avons commencé par l'hybridation in situ par fluorescence ex vivo (FISH) et la coloration par immunofluorescence du marqueur d'activité neuronale Fos dans la région POA ciblée par ultrasons (Fig. 4a et Extended Data Fig. 6). L'expression de Fos était élevée dans l'aire préoptique médiale (MPA ; 10,17 ± 1,30 % contre 1,85 ± 0,69 %), le noyau préoptique médian (MPO ; 7,58 ± 0,51 % contre 1,38 ± 0,57 %) et le noyau périventriculaire (Pe ; 6,68 ± 1,39 % contre 1,43 ± 0,82 %) (Fig. 4b ). Nous avons ensuite étudié la dynamique de l'activité neuronale dans le POA en réponse aux ultrasons. Nous avons exprimé les GCaMP6 rapporteurs de calcium (Ca2 +) dans les neurones POA, installé une fibre optique dans la même région et enregistré en continu la dynamique de l'activité Ca2 + avant, pendant et après la stimulation par ultrasons à l'aide de la photométrie à fibre (Fig. 4c). Nous avons observé une augmentation constante, robuste et répétée de l'activité neuronale en réponse à chaque impulsion ultrasonore (Fig. 4d). L'activité neuronale enregistrée lors de la stimulation ultrasonore a été caractérisée par une augmentation de l'amplitude maximale (de 0,17 ± 0,30 à 2,03 ± 0,42), du score z moyen (de 0,09 ± 0,28 à 1,69 ± 0,40) et de la fréquence maximale (de 0 à 5,7 ± 1,08 min−1) par rapport à l'activité neuronale mesurée avant la stimulation ultrasonore (Fig. 4e). La tendance des changements d'activité de Ca2+ était alignée sur la tendance des changements de température corporelle (Fig. 4d). Ces résultats ont révélé que l'UIH était évoquée par l'activation par ultrasons des neurones POA. Notre découverte que la stimulation transcrânienne du POA était suffisante pour induire l'UIH a révélé le rôle critique du POA dans l'orchestration d'un état de torpeur chez la souris.

a, En haut : analyse d'hybridation in situ du marqueur Fos dans la région POA chez des souris avec (US+) et sans (US–) stimulation US. L'insert montre la région du cerveau où ces images ont été obtenues. Distribution spatiale du signal Fos enregistré avec l'atlas du cerveau de la souris (en bas). LPO, aire préoptique latérale ; VLPO, noyau préoptique ventrolatéral ; VMPO, noyau préoptique ventromédian. b, Fraction de cellules Fos+ dans différentes régions cérébrales POA dans les groupes US+ et US–. n = 6 souris pour le groupe US+ et n = 4 souris pour le groupe US-, à l'exception de la quantification VLPO dans le groupe US+ où n = 5 souris ont été utilisées. Les barres d'erreur indiquent sem c, Illustration schématique pour l'enregistrement photométrique par fibre de l'activité neuronale Ca2+ dans le POA ciblé par les États-Unis (créé avec BioRender.com) (à gauche). L'IRM d'une souris montre l'alignement confocal de la fibre optique (ligne pointillée verte) et du transducteur américain (marron) dans la région POA (à droite). d, activités Ca2+ représentatives (en haut) des neurones POA recevant une stimulation US et la courbe TBAT correspondante (en bas). La stimulation US est composée de six stimuli individuels. e, signal Ca2+ en réponse à chaque impulsion US de n = 7 souris. Sur la base de ce signal Ca2 +, l'amplitude maximale, le score z moyen et la fréquence ont été quantifiés dans trois fenêtres avant (5 s), pendant (10 s) et après (15 s) stimulation US (n = 7 souris). Pour les boîtes à moustaches, la ligne centrale et les limites de la boîte indiquent que les valeurs moyennes ± sem P ont été calculées par le test t bilatéral non apparié (b) et le test t bilatéral apparié (e).

Données source

Pour identifier la molécule sensible aux ultrasons qui permet l'activation des neurones POA associés à l'induction de l'UIH (neurones POAUIH), nous avons effectué un séquençage d'ARN à noyau unique à haut débit (snRNA-seq) de la région POA ciblée par ultrasons. Nous avons disséqué les régions POA (n = 4 souris pour le groupe US+ et n = 4 souris pour le groupe US− sham), les avons dissociées pour collecter des noyaux uniques et présélectionner les noyaux des neurones à l'aide du marqueur NeuN. Un total de 35 amas neuronaux divers contenant 21 886 neurones (Fig. 5a) ont été identifiés à l'aide d'un regroupement basé sur des graphes non supervisé28. Parmi eux, 11 clusters sont excitateurs (dont 2 clusters hybrides) et 24 sont inhibiteurs (dont 3 clusters hybrides) (Fig. 5b), ce qui est cohérent avec la grande diversité de types cellulaires dans le POA11,29. Des études récentes ont identifié que les neurones associés à la torpeur sont caractérisés par des marqueurs génétiques spécifiques, notamment Adcyap1 (codant pour le polypeptide-1 activant l'adénylate cyclase)11, Qrfp (peptide RFamide pyroglutamylé)12 et Esr1 (récepteur des œstrogènes-1)15. De plus, la majorité de ces neurones ont été classés comme excitateurs ou hybrides. Nous avons utilisé ces trois marqueurs pour identifier les neurones associés à la torpeur en effectuant un clustering k-means30 et avons trouvé sept clusters associés à la torpeur qui étaient des neurones excitateurs ou hybrides (Fig. 5b).

a, tracé UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) de 21 886 noyaux neuronaux. Différentes couleurs représentent différentes populations neuronales. Les niveaux d'expression des trois principaux gènes marqueurs représentatifs spécifiques à la classe sont codés par couleur (bleu) sur UMAP : Gad1 pour les clusters inhibiteurs, Slc17a6 pour les clusters excitateurs et Adcyap1 + pour les clusters associés à la torpeur. b, Expression de gènes marqueurs excitateurs et inhibiteurs à travers différents types de cellules neuronales (organisés par k-means clustering) (en haut). Expression de gènes marqueurs associés à la torpeur (Adcyap1, Esr1 et Qrfp) dans des populations neuronales excitatrices et hybrides (regroupées sur la base de ces gènes associés à la torpeur) (milieu). Expression de tous les gènes codant pour les familles de canaux TRP et PIEZO dans tous les clusters associés à la torpeur, qui ont été classés selon le niveau d'expression des IEG (en bas). La barre rose indique le cluster qui a été activé par les États-Unis. c, Le niveau d'expression de Trpm2 est codé par couleur (bleu) sur UMP. Le cluster h0 associé à la torpeur activé par les États-Unis est étiqueté dans le graphique. d, Image FISH représentative d'Adcyap1 et Trpm2 dans la région POA de deux sections coronales de différents niveaux. Les analyses FISH ont été répétées chez cinq souris. Les coordonnées antéro-postérieures relatives au bregma sont indiquées sur la base de l'Allen Mouse Brain Atlas62.

L'hypothèse communément admise pour la neuromodulation par ultrasons est l'activation de canaux ioniques endogènes sensibles aux ultrasons. Bien que des études antérieures aient rapporté l'activation de plusieurs canaux ioniques des familles PIEZO et TRP (y compris PIEZO1/2 (réfs. 31,32), TRPA1 (réf. 33), TRPV1 (réf. 34), TRPP1/2 et TRPC1 (réf. 35)), ces études ont été réalisées principalement in vitro en utilisant des cellules en culture. Aucune étude n'a été réalisée in vivo pour cribler les canaux ioniques candidats pour révéler les canaux ioniques sensibles aux ultrasons sur les neurones du cerveau. Ici, nous avons examiné tous les gènes des familles de canaux TRP (TRPV, TRPM, TRPC, TRPP, TRPA et TRPML) et PIEZO dans les neurones excitateurs associés à la torpeur et avons trouvé une large expression de gènes codant pour les familles de canaux TRP, notamment les canaux ioniques TRPV, TRPM, TRPC, TRPA et PIEZO (Fig. 5b). Parmi les sept populations neuronales associées à la torpeur, nous avons ensuite identifié une population spécifique caractérisée par une expression élevée de cinq marqueurs d'activation neuronale, notamment Fos, Fosb, Nr4a1, Egr1 et Dusp1, également connus sous le nom de gènes précoces immédiats (IEG), indiquant que cette population neuronale était activée par ultrasons. Nous nous référons aux neurones POAUIH de la population neuronale associée à la torpeur activée par ultrasons. En évaluant tous les gènes des canaux TRP et PIEZO, nous avons constaté que le niveau d'expression de TRPM2 était élevé dans les neurones POAUIH (Fig. 5b, c).

Pour vérifier que le canal ionique TRPM2 est sensible aux ultrasons, nous avons effectué une analyse FISH ex vivo et avons constaté que Trpm2 était coexprimé avec Fos, avec un pourcentage de coexpression de 27, 53 ± 9, 75% (Fig. 6a, b). Nous avons ensuite évalué la sensibilité aux ultrasons de TRPM2 en le surexprimant dans des cellules HEK293T. Nous avons constaté que les ultrasons induisaient avec succès un afflux de Ca2+ dans les cellules surexprimant TRPM2, ce qui n'était pas observé dans les cellules de type sauvage (Fig. 6c, d). La réponse Ca2 + évoquée par ultrasons dans les cellules TRPM2 + a été supprimée de manière significative par le bloqueur TRPM2 2-APB (Fig. 6c, d). Ces résultats confirment fortement que TRPM2 est un canal ionique sensible aux ultrasons.

a, Images FISH représentatives de Fos et Trpm2. Les cellules coexprimant Fos et Trpm2 sont encerclées. b, Le pourcentage de cellules Fos+ dans les populations exprimant Trpm2 (Trpm2+) par rapport à la population dépourvue d'expression de Trpm2 (Trpm2-). n = 4 souris. c, Images de fluorescence Ca2+ de cellules HEK293T in vitro sans surexpression de TRPM2 (à gauche), avec surexpression de TRPM2 (au milieu) et avec surexpression de TRPM2 et bloqueur 2-APB (à droite). Avant la stimulation US (en haut) ; après stimulation US (en bas). n = 5 tests indépendants. WT, type sauvage. d, Carte thermique du signal Ca2+ normalisé (ΔF/F) de 100 cellules sélectionnées au hasard à partir de cinq tests indépendants dans ces trois groupes. Les lignes pointillées indiquent l'heure d'activation et de désactivation de la stimulation US. e, ΔTBAT (changement du TBAT par rapport à la ligne de base) de souris injectées avec du shRNA pour renverser TRPM2 (TRPM2-KD) (à gauche). Max ΔTBAT (à droite) a été déterminé comme le ΔTBAT le plus bas pendant l'intervalle de 7 à 12 minutes après le début de la stimulation US, sur la base du tracé de gauche. Le groupe fictif a reçu une injection de shRNA brouillé. n = 5 souris pour le groupe fictif et n = 7 souris pour le groupe TRPM2-KD. f, signal Ca2 + en réponse à la sonication US (barre rose) chez les souris TRPM2-KD par rapport au groupe fictif. L'amplitude maximale de la courbe Ca2+ a été quantifiée pour le groupe TRPM2-KD et le groupe fictif. n = 8 souris pour le groupe fictif et n = 10 souris pour le groupe TRPM2-KD. Les lignes pleines et les ombres dans les courbes indiquent la moyenne ± sem Les barres d'erreur indiquent la sem La stimulation US est marquée par des barres roses. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié en b et e. Le test t bilatéral apparié a été utilisé dans f lors de la comparaison de l'amplitude maximale avant et pendant la stimulation américaine.

Données source

Pour vérifier que le canal ionique TRPM2 est impliqué dans l'UIH, nous avons effectué une analyse d'hybridation in situ et constaté que Trpm2 était colocalisé avec le marqueur moléculaire des neurones associés à la torpeur Adcyap1 avec un pourcentage de coexpression de 35, 7 ± 5, 3% (Fig. 5d). Nous avons en outre étudié les rôles de TRPM2 dans l'UIH en utilisant des lentivirus-shRNA pour abattre spécifiquement les niveaux d'expression de TRPM2 (TRPM2-KD) dans la région POA. L'analyse Western blot a confirmé le succès de l'inactivation de TRPM2 (Extended Data Fig. 7). Les souris TRPM2-KD ont considérablement diminué l'UIH. La réduction de la température du TBAT a diminué de 41, 2% chez les souris TRPM2-KD par rapport au témoin (Fig. 6e). L'amplitude du signal Ca2 + évoqué par ultrasons dans le POA a diminué jusqu'à presque la ligne de base chez les souris TRPM2-KD (Fig. 6f). Ces résultats ont démontré que TRPM2 était impliqué dans l'induction de l'UIH.

Nous avons ensuite étudié les régions cérébrales potentielles en aval associées à l'activation des neurones POA au cours de l'UIH. Les régulations métaboliques et thermiques ont été précédemment signalées comme étant coordonnées par des projections de POA vers l'hypothalamus dorsomédian (DMH)36,37, le noyau arqué (ARC)36 et l'hypothalamus ventromédian (VMH)36, qui sont situés dans la région hypothalamique postérieure au POA. Nous avons effectué l'analyse FISH du marqueur Fos dans ces régions hypothalamiques suite à une stimulation ultrasonore au POA. Nous avons détecté une expression accrue de Fos dans plusieurs zones hypothalamiques, notamment DMH, ARC et l'hypothalamus latéral (LH) (Fig. 7a, b). L'expression de Fos la plus élevée a été observée dans le DMH (6, 00 ± 0, 91% en US +) (Fig. 7b). Nous avons enregistré le signal Ca2 + dans la région DMH en utilisant la photométrie à fibre tout en ciblant simultanément les ultrasons au POA pour étudier l'activité neurale du DMH pendant l'UIH (Fig. 7c). Nous avons observé que l'amplitude maximale moyenne du signal Ca 2 + des neurones DMH augmentait lors de la stimulation ultrasonore au POA (de 0, 04 ± 0, 20 à 0, 41 ± 0, 15; Fig. 7d, e), démontrant que l'activation des neurones DMH est associée à l'UIH. Ces résultats ont indiqué que le DMH est potentiellement impliqué dans le circuit neuronal qui régule l'UIH, tandis que d'autres régions du cerveau (par exemple, l'ARC et le VMH) peuvent également agir comme des nœuds dans le réseau neuronal de la torpeur.

a, coloration FISH du marqueur Fos dans les régions hypothalamiques autour du DMH chez des souris avec (US +) et sans (US–) stimulation US (à gauche). Les emplacements de ces images sont indiqués dans l'atlas du cerveau (encart). Distribution spatiale du signal Fos enregistré dans l'atlas du cerveau de la souris (à droite). TU, tubercule olfactif. b, Fraction de cellules Fos+ dans le DMH, ARC, LH, VMH et TU pour les souris US+ et US–. n = 5 souris pour le groupe US+ et n = 4 souris pour le groupe US−. Les barres d'erreur indiquent sem c, configuration pour l'enregistrement photométrique de l'activité neuronale Ca2 + dans le DMH simultanément avec le ciblage américain au POA. d, activité Ca2+ des neurones DMH au cours de l'US stimulant les neurones POA. n = 5 souris. Les lignes pleines et les ombres dans les courbes indiquent la moyenne ± sem e, l'amplitude maximale (à gauche), le score z moyen (au milieu) et la fréquence (à droite) de l'activité neuronale DMH avant, pendant et après la stimulation américaine dans la région POA. n = 5 souris. f, illustratif de l'hypothèse selon laquelle l'UIH est médiée par la thermogenèse et la dépense énergétique de la MTD dépendante de l'UCP1. g, Tcore pendant la stimulation américaine comparant les souris WT et UCP1-knockout (UCP1-KO) (à gauche). Max ΔTcore (Tcore le plus bas - Tcore moyen avant US) (à droite). h, VO2 pendant la stimulation US chez les souris WT et UCP1-KO (à gauche). Max ΔVO2 (VO2 le plus bas - VO2 moyen avant la stimulation par ultrasons) (à droite). En g et h, les lignes pleines et les ombres dans les courbes indiquent la moyenne ± sem ; les barres d'erreur indiquent sem ; n = 6 souris pour le groupe WT et n = 5 souris pour le groupe UCP1-KO. La valeur P a été calculée à l'aide du test t bilatéral non apparié (b, g, h) et du test t bilatéral apparié (e). c et f ont été créés avec BioRender.com.

Données source

L'hypothalamus est connu pour être connecté au système nerveux sympathique qui modifie la thermogenèse et la dépense énergétique des tissus effecteurs périphériques38. Nous avons observé la diminution de la température du BAT pendant l'UIH (Fig. 2a, b), indiquant que le BAT est un tissu effecteur en aval des circuits neuronaux de l'UIH (Fig. 7f). Comme UCP1 est la protéine mitochondriale cruciale responsable de la thermogenèse BAT39, nous avons utilisé des souris UCP1-KO pour UIH et comparé les changements de Tcore et VO2 avec ceux du contrôle de type sauvage. Nous avons constaté que la profondeur de l'hypothermie induite par les ultrasons (mesurée par max ΔTcore) était environ 2, 2 fois plus faible chez les souris UCP1-KO que chez les souris de type sauvage (Fig. 7g). L'étendue de l'hypométabolisme (mesurée par max ΔVO2) était 1, 7 fois plus faible chez les souris UCP1-KO que chez les souris de type sauvage (Fig. 7h); cependant, cet état hypothermique et hypométabolique n'a pas été entièrement aboli chez les souris UCP1-KO. Ces résultats ont confirmé que BAT est un tissu effecteur qui régule les changements de température corporelle et de taux métabolique pendant l'UIH.

Les souris sont bien équipées pour entrer dans un état de torpeur sous restriction calorique. Pour évaluer si l'UIH peut être évoquée chez des animaux non torpides, nous avons effectué une stimulation par ultrasons chez des rats, une espèce qui ne montre ni hibernation ni torpeur quotidienne12,14. L'échographie a été délivrée à distance dans la région POA de rats se déplaçant librement à l'aide du transducteur à ultrasons portable avec une conception similaire à celle utilisée chez les souris (Fig. 1b). Nous avons trouvé une diminution de la température cutanée, en particulier dans la région BAT (TBAT) après stimulation par ultrasons (Fig. 8a, b). La stimulation par ultrasons a également induit une diminution significative de la température corporelle centrale (max ∆Tcore = -1, 33 ± 0, 22 ° C) chez les rats (Fig. 8c). Bien que le degré de réduction de la température corporelle soit plus faible chez les rats que chez les souris, ces données démontrent la faisabilité de l'UIH chez un animal non torpide.

a, images thermiques infrarouges d'un rat recevant une stimulation US au POA. b, TBAT des rats recevant une sonication au POA (US+, n = 12) par rapport aux rats témoins sans stimulation US (US–, n = 4). c, courbes Tcore dans les groupes US+ (n = 6) et US– (n = 6) (à gauche). Comparaison du ΔTcore max entre les groupes US+ et US– (à droite). Les lignes pleines et les ombres dans les courbes indiquent la moyenne ± sem Les barres d'erreur indiquent sem La valeur P a été calculée à l'aide d'un test t non apparié à deux queues.

Données source

Dans cette étude, nous avons développé la technique UIH qui induit de manière non invasive, précise et sûre un état de torpeur chez la souris. Nous avons révélé que l'UIH était évoquée par l'activation par ultrasons des neurones POA. Les neurones POAUIH avaient une expression élevée du canal ionique TRPM2, qui s'est avéré sensible aux ultrasons et a contribué à l'induction de l'UIH. De plus, nos résultats indiquent l'implication potentielle de l'hypothalamus dorsomédian en tant que région cérébrale en aval et du tissu adipeux brun en tant que tissu effecteur dans l'UIH. Nous avons démontré que la stimulation ultrasonore au POA évoquait un état d'hypothermie chez un animal non torpide (rat).

Nos résultats ont démontré que la stimulation par ultrasons du POA supprimait globalement les processus physiologiques d'une manière qui ressemblait à la torpeur naturelle. La stimulation par ultrasons a supprimé de manière systémique le métabolisme et la thermogenèse, basculé l'utilisation du substrat énergétique vers la graisse et diminué la fréquence cardiaque, qui sont collectivement des caractéristiques clés de la torpeur naturelle11,23. Il a été constaté qu'une stimulation par ultrasons unique induisait un état hypothermique et hypométabolique pouvant durer jusqu'à environ 1 h, ce qui correspond à une torpeur naturelle24,25. Cette durée prolongée était également cohérente avec un rapport précédent qui a révélé que l'activation optogénétique des neurones QRFP dans le POA entraînait un état d'hypothermie d'une durée supérieure à 30 minutes après une illumination lumineuse de 1 s. La durée relativement prolongée de cet état est en partie attribuée au lent processus de thermogenèse lors du réchauffement40. Il est également possible que des circuits neuronaux impliqués dans le maintien de cet état hypothermique et hypométabolique soient activés directement ou indirectement par la stimulation ultrasonore. Malgré la similitude entre l'UIH et la torpeur naturelle, il existe encore des différences entre ces deux états en ce qui concerne les tissus effecteurs en aval. Nous avons constaté que BAT est impliqué dans le processus UIH médié par UCP1 qui régule à la fois la profondeur de l'hypothermie et de l'hypométabolisme et l'excitation de l'UIH (Extended Data Fig. 8). Dans la torpeur naturelle, cependant, il a été rapporté que l'UCP1 contribuait principalement à l'éveil de la torpeur, et non à la profondeur de l'hypothermie et de l'hypométabolisme40. De plus, la température de la queue de la souris a augmenté pendant l'UIH, peut-être pour améliorer la dissipation thermique par vasodilatation. Ce phénomène n'a pas été rapporté dans la torpeur quotidienne induite par le jeûne41. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour caractériser et comprendre les similitudes et les différences entre l'état UIH et la torpeur naturelle en ce qui concerne les caractéristiques physiologiques, les circuits neuronaux et les tissus effecteurs.

La régulation coordonnée à l'échelle mondiale des comportements associés à la torpeur en déduit que les ultrasons ont modulé les populations neuronales associées à la torpeur dans la POA. En effet, le séquençage de l'ARN à noyau unique a révélé que les ultrasons activaient les populations neuronales associées à la torpeur précédemment signalées dans la POA, qui sont caractérisées par les gènes marqueurs d'Adcyap1, Qrfp et Esr1 (réf. 11, 12, 15). Nous avons découvert que TRPM2 est un canal ionique sensible aux ultrasons dans les neurones POAUIH. Notre étude fournit des preuves in vivo révélant que les ultrasons modulent les activités neuronales dans le cerveau en activant les canaux ioniques endogènes. TRPM2 a déjà été découvert dans les neurones POA sensibles à la chaleur qui régulent la température corporelle42. Nous avons constaté que TRPM2 est nécessaire pour induire l'UIH. Cette étude s'est concentrée sur TRPM2, qui était le canal ionique le plus exprimé dans les neurones POAUIH parmi les canaux ioniques inclus dans notre analyse. En plus de TRPM2, nous avons également observé une large expression d'autres familles de canaux TRP et PIEZO dans les populations neuronales associées à la torpeur. L'inactivation de TRPM2 a partiellement supprimé la profondeur de l'UIH mais n'a pas entièrement aboli l'effet UIH, ce qui suggère que d'autres canaux ioniques ou molécules sensibles aux ultrasons sont également impliqués dans l'activation par ultrasons des neurones POA pour induire l'hypothermie et l'hypométabolisme.

Les mécanismes biophysiques de l'activation ultrasonore des neurones POA et du canal ionique TRPM2 restent à découvrir. TRPM2 est un canal cationique perméable au Ca2+, non sélectif et sensible aux changements de température43,44. Nous avons mesuré la température de la POA pendant la sonication par ultrasons à l'aide de la thermométrie d'imagerie par résonance magnétique (IRM) in vivo. L'augmentation de température à POA était de 2, 58 ± 0, 26 ° C (données étendues Fig. 9), ce qui suggère que l'effet thermique induit par les ultrasons a contribué à l'activation des neurones POA. En analysant la corrélation entre l'activation neurale et l'augmentation de la température du POA, nous avons constaté que le temps médian d'apparition de l'activation neurale se produisait à 1,17 s. L'augmentation médiane de la température au début de l'activation neurale était de 0, 06 ° C (données étendues Fig. 9). Cette faible élévation de température suggère que l'effet mécanique (non thermique) induit par les ultrasons a également contribué à l'activation des neurones POA. De même, nous avons observé une élévation de température dans la chambre de culture cellulaire lors de la stimulation par ultrasons des cellules TRPM2+ HEK293. Nous avons constaté que l'augmentation médiane de la température correspondant au début de l'activité Ca2+ des cellules TRPM2+ était de 0,34 °C (Extended Data Fig. 10). En résumé, les neurones POA et le canal ionique TRPM2 sont susceptibles d'être activés par les effets mécaniques et thermiques des ultrasons.

Les neurones POA coordonnent l'activation de plusieurs zones cérébrales en aval pour orchestrer la torpeur ; cependant, ce circuit complexe à l'échelle du cerveau est encore largement inconnu. Nous avons constaté que l'induction de l'UIH était corrélée à l'activation des neurones DMH lors de la stimulation ultrasonique au POA. Cette découverte est cohérente avec les circuits neuronaux précédemment rapportés selon lesquels les neurones POA associés à la torpeur Qrfp et Adcyap1 projettent vers le DMH pour induire l'hypothermie et l'hypométabolisme pendant la torpeur induite génétiquement ou induite par le jeûne11,12. Notre étude suggère également que d'autres régions cérébrales en aval, telles que l'ARC, peuvent également être impliquées dans la coordination de l'UIH. L'ARC, une zone de l'hypothalamus essentielle à la régulation de l'homéostasie énergétique, a été suggérée comme la région cruciale en aval recevant la projection des neurones Esr1 + induisant la torpeur dans POA15. Ces résultats suggèrent que la stimulation par ultrasons induit une hypothermie et un hypométabolisme de type torpeur en modulant les circuits neuronaux impliqués dans la torpeur naturelle. Cette étude a également révélé que le tissu effecteur en aval, BAT, était impliqué dans la réglementation UIH. BAT a déjà été étudié dans le contexte de la thermogenèse39,45, alors que son rôle dans la régulation de la torpeur n'a pas été entièrement exploré40,46,47. Nous avons constaté que BAT est l'un des principaux tissus effecteurs qui interviennent dans les changements de température corporelle et de taux métabolique au cours de l'UIH et que ces effets dépendent de l'UCP1.

L'UIH a le potentiel d'atteindre l'objectif longtemps recherché de parvenir à une induction non invasive et sûre de l'état de torpeur, qui a été poursuivi par la communauté scientifique au moins depuis les années 1960. Dans le passé, des efforts considérables ont été consacrés à l'identification d'agents pharmacologiques qui suppriment systématiquement le métabolisme et induisent un état de type torpeur. Ces agents, tels que le sulfure d'hydrogène9, l'adénosine monophosphate48, les delta-opioïdes49, la N6-cyclohexyladenosine14,50 et les cocktails de composés chimiques51, manquent de spécificité anatomique et fonctionnelle et induisent des effets secondaires systémiques hors cible52, ce qui limite leurs utilisations. Des études récentes ont proposé des approches pour induire la torpeur en ciblant le SNC par injection chirurgicale d'agents pharmaceutiques dans le cerveau ou par génie génétique des circuits neuronaux associés à la torpeur. Ces approches sont d'une importance cruciale pour étudier la voie nerveuse centrale de la torpeur, mais les besoins d'intervention chirurgicale dans le cerveau et le génie génétique limitent leur traduction chez l'homme. Par rapport à d'autres techniques de neuromodulation non pharmacologiques et non génétiques (par exemple, la stimulation cérébrale profonde, la stimulation magnétique transcrânienne et la stimulation transcrânienne à courant continu), la stimulation par ultrasons possède une capacité unique à atteindre de manière non invasive les régions cérébrales profondes avec une précision spatiale et temporelle élevée dans les cerveaux animaux et humains. L'UIH utilise la stimulation ultrasonore transcrânienne pour induire l'hypothermie et l'hypométabolisme en stimulant de manière non invasive le régulateur principal de la torpeur, le POA. Il représente une technique non invasive et sûre qui induit une hypothermie et un hypométabolisme de type torpeur en ciblant le SNC.

Comme il a déjà été démontré que la neuromodulation par ultrasons était réalisable chez l'homme, l'UIH est très prometteuse pour être traduite chez l'homme. Une question valable est de savoir si l'UIH peut être extrapolée de la souris à l'homme. Nous avons montré que la stimulation par ultrasons induit une hypothermie chez les rats, qui n'entrent pas naturellement en torpeur, suggérant la possibilité que des effets similaires puissent être induits chez l'homme. Une régulation précise des ultrasons des neurones POA peut entraîner une hypothermie et un hypométabolisme de type torpeur chez l'homme, bien que beaucoup de travail reste à faire. L'UIH pourrait débloquer des applications allant des nouveaux traitements médicaux aux vols spatiaux habités de longue durée.

Pour la caractérisation initiale de l'effet d'hypothermie et d'hypométabolisme de type torpeur induit par les États-Unis, nous avons utilisé des souris C57BL/6NCrl mâles et femelles adultes (âgées de 6 à 9 semaines) (Charles River Laboratories) qui ont été assignées au hasard à des groupes expérimentaux. Des souris knock-out UCP1 (femelles, âgées de 2 à 4 mois) ont été fournies par le laboratoire de J. Brestoff. Des rats Wistar Han IGS femelles et mâles (Charles River Laboratories, code de souche 273) âgés de 4 à 6 semaines ont été utilisés dans cette étude. Toutes les souris et tous les rats ont été hébergés dans une animalerie de la Washington University School of Medicine. Les animaux ont été maintenus dans un environnement à température contrôlée (23 à 26 ° C) et à humidité contrôlée (35 à 65%), avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et ont reçu un régime alimentaire standard. Toutes les études animales ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Washington à St. Louis conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour la recherche animale (protocole animal n° 21-0187).

Nous avons conçu des transducteurs US portables miniaturisés pour fournir une stimulation US chez des souris en mouvement libre. Le transducteur a été fabriqué à l'aide d'un résonateur en céramique de titanate de zirconate de plomb (DL-43, DeL Piezo Specialties) avec une fréquence centrale de 3,2 MHz, une ouverture de 13 mm et une profondeur focale géométrique de 10 mm. Chaque transducteur a été calibré par un hydrophone (HGL-200, Onda) dans de l'eau dégazée et déminéralisée avec et sans crâne de souris ex vivo. La pleine largeur à mi-hauteur du transducteur US était de 0,8 mm et 3,8 mm dans les directions latérale et axiale, respectivement.

Le transducteur US portable a été fixé à la tête de la souris par la conception «plug-in» sur une plaque de base qui a été collée sur le crâne de la souris avant l'expérience (Extended Data Fig. 1). Pour coller la plaque de base, la souris a été anesthésiée et la tête a été fixée à l'aide d'un cadre stéréotaxique. Un stylo marqueur a été attaché au cadre stéréotaxique et utilisé pour dessiner un point sur le crâne pour indiquer la région POA en utilisant ses coordonnées en référence au bregma (AP = 0, 2 mm et ML = 0, 2 mm par rapport au bregma). La plaque de base a été implantée sur le dessus du crâne de la souris à l'aide d'un insert. L'insert avait un trou au centre, qui était aligné avec le point sur le crâne pour cibler la région cérébrale souhaitée. Après ce processus de ciblage, l'insert a été retiré et la plaque de base a été collée sur le crâne à l'aide de ciment adhésif. Pour l'expérience de contrôle hors cible, la plaque de base a été implantée pour cibler le cortex (AP = 3, 0 mm et ML = 0 mm, par rapport au bregma) ou l'hippocampe ventral, qui est situé à la même profondeur que POA (AP = −2, 7 mm, ML = 2, 7 mm et DV = − 5, 0 mm). Après l'implantation de la plaque de base, les animaux ont pu se remettre de la chirurgie et s'adapter à la plaque de base pendant au moins 3 jours. Avant chaque expérience de stimulation américaine, le transducteur américain portable a été rempli de gel américain dégazé (Aquasonics), puis branché sur la plaque de base sur la tête de la souris sous anesthésie légère à l'aide d'isoflurane (1 à 1,5 % d'isoflurane). La durée totale de cette préparation était d'au plus 15 min pour minimiser l'effet de l'anesthésie. La profondeur de ciblage des États-Unis (direction DV) a été contrôlée en personnalisant la hauteur du boîtier en forme de cône. La distance focale du transducteur de forme concave était d'environ 8 mm. La hauteur du boîtier du transducteur a été conçue pour être d'environ 3 mm pour cibler le POA et l'hippocampe ventral (en tant que contrôle hors cible), qui sont à une profondeur de 5 mm. La hauteur du boîtier du transducteur a été conçue pour être de 7 mm pour cibler le cortex, qui est à une profondeur de 1 mm. La profondeur focale (pertinente pour le crâne) de l'US portable a été validée par l'étalonnage de l'hydrophone avec le crâne de souris ex vivo (Extended Data Fig. 1). Les souris ont ensuite été autorisées à récupérer de l'anesthésie et à s'habituer à la plate-forme de test de comportement pendant environ 90 minutes avant la première stimulation. L'installation de la plaque de base et la conception du transducteur américain portable étaient similaires dans les expériences sur les rats, à l'exception de la fréquence centrale (1,5 MHz dans les expériences sur les rats) et des coordonnées de ciblage (AP = 0 mm, ML = 0 mm et DV = ~ 8,5 mm).

La stimulation US a été réalisée en utilisant les paramètres suivants : fréquence fondamentale de 3,2 MHz pour les souris et 1,5 MHz pour les rats, pic de pression acoustique négative (pression in situ avec atténuation crânienne considérée) de 1,6 MPa pour les souris et 1,4 MPa pour les rats, rapport cyclique de 50 %, fréquence de répétition des impulsions de 10 Hz, durée du stimulus de 10 s, intervalle inter-stimulus de 30 s, nombre de stimulus de 6 (souris) ou 20 (rats). Dans l'étude des paramètres, la durée du stimulus (2 à 10 s) et la pression acoustique (0, 4, 0, 8, 1, 2 et 1, 6 MPa) ont été modifiées, tandis que les autres paramètres sont restés les mêmes. Pour éviter d'activer la voie auditive par stimulation US, nous avons appliqué une enveloppe lissée au début et à la fin de chaque forme d'onde US en utilisant une méthode rapportée précédemment53. La forme d'onde a été générée dans MATLAB (R2021a, Mathworks) en appliquant une enveloppe de fonction gaussienne au début et à la fin de la forme d'onde pour réduire la génération de composants de fréquence à large bande. La fréquence de répétition des impulsions était de 10 Hz, ce qui est en dehors de la plage d'audition de la souris54,55. La forme d'onde programmée a ensuite été entrée dans un générateur de fonctions (33500B, Agilent), amplifiée via un amplificateur de puissance (1020L, ENI) et transmise au transducteur américain. Aucune adaptation d'impédance électrique n'était nécessaire car la partie réelle de l'impédance du transducteur à la fréquence de résonance, telle que mesurée par un analyseur de réseau E5061A ENA avec le kit de sonde diélectrique 85070E (Agilent Technologies), était comprise entre 31 et 59 ohms, ce qui était suffisamment proche des 50 ohms nécessaires pour une adaptation d'impédance parfaite.

La température corporelle de surface avant, pendant et après la stimulation US a été enregistrée à l'aide d'une caméra thermique. Les souris avec le transducteur US portable attaché ont été placées dans une plate-forme de test en plein champ, qui était une boîte de 20 cm (hauteur) × 10 cm (largeur) × 10 cm (longueur). Une caméra thermique infrarouge (caméra FLIR E54, FLIR Systems) a été positionnée à 60 cm au-dessus de la boîte pour capturer la température corporelle de la souris avec le logiciel FLIR ResearchIR (v.4). Pour assurer des mesures précises de la température de surface, la fourrure sur le dos de l'animal a été retirée à l'aide d'une tondeuse à cheveux avant le début de l'expérience. Cette procédure d'épilation a été réalisée dans toutes les expériences, y compris les groupes de contrôle US+ et US−. Une webcam (C920, Logitech) a été placée à côté de la caméra thermique pour capturer le comportement de la souris à l'aide du logiciel Bonsai (v.2.7) en synchronisation avec la caméra thermique. La température ambiante a été maintenue constante à ~ 22 ° C pour toutes les expériences. Le TBAT a été calculé automatiquement à l'aide de la combinaison de FLIR Tool (v.6.4), Bonsai et du logiciel MATLAB avec les étapes suivantes : (1) suivi de l'emplacement du BAT dans Bonsai en estimant le centre du BAT à 25 % de la longueur du corps en avant du centroïde du corps ; et (2) calculer la température moyenne dans la région d'intérêt définie par un cercle de 3 mm de rayon centré à l'emplacement BAT identifié à l'aide de MATLAB. La température de la queue a été calculée manuellement en sélectionnant une région d'intérêt circulaire de 2 mm de diamètre centrée sur les 1 cm proximal de la queue. La variation maximale de la température BAT (max ∆TBAT) a été calculée en calculant la différence entre la température minimale BAT obtenue dans l'intervalle de 7 à 12 min suivant le début de l'US et la température corporelle de base, qui a été définie comme la température corporelle moyenne mesurée 15 min avant la stimulation US. Ce calcul a été effectué après l'application d'un filtre passe-bas au signal brut pour éliminer les fluctuations induites par la caméra haute fréquence pour un résultat plus précis.

Pour les mesures de la température corporelle centrale (Tcore), du taux de consommation d'oxygène (VO2) et des enregistrements RQ, chaque souris a été logée dans une cage métabolique à l'intérieur du système complet de surveillance des animaux de laboratoire à température contrôlée (CLAMS) (Columbus Instruments). Le transducteur américain a été fixé au sommet de la cage métabolique avec un adaptateur de joint rotatif pour s'assurer que la souris pouvait se déplacer librement dans la cage avec le transducteur américain portable sans l'enchevêtrement de fil. Les souris ont d'abord été adaptées au CLAMS pendant 1 jour avant chaque expérience. Les taux de consommation d'oxygène (VO2) et de production de dioxyde de carbone (VCO2) ont été mesurés à l'aide d'un capteur rapide OxyMax (Columbus Instruments) toutes les ~ 3 min avec huit cages mesurées en série pendant 20 s chacune (purge de la ligne aérienne 18 s; mesure 2 s) et enregistrées à l'aide du logiciel statistique CLAX. Les souris dans les cages métaboliques ont également été implantées avec des capteurs de température de télémétrie (TA-XS, Stellar Telemetry, TSE Systems) pour l'enregistrement de la température corporelle centrale en synchronisation avec les enregistrements métaboliques. Les souris avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau tout au long de l'expérience. La variation maximale de la température corporelle centrale (max ∆Tcore) a été calculée en calculant la différence entre la température corporelle minimale obtenue dans la période de 30 min suivant le début de l'US et la température corporelle de référence (définie comme la température corporelle moyenne de la fenêtre de 5 min survenant 1 min avant la stimulation US). La variation maximale du taux de consommation d'oxygène (ΔVO2 max) a été calculée en utilisant la même méthode. Le ΔRQ maximum a été calculé en déterminant la différence entre le QR le plus bas observé dans la fenêtre de 45 à 55 min suivant le début de l'US et le taux métabolique de base, qui a été défini comme le QR moyen mesuré dans une fenêtre de 28 min survenant 2 min avant la stimulation américaine. Une souris a été exclue de la courbe Tcore de la figure 2c en raison d'un enregistrement incomplet résultant d'une défaillance du capteur de télémétrie. Le début était le moment où Tcore ou VO2 était inférieur au seuil, défini comme la valeur moyenne de la ligne de base - 2 × sd de la ligne de base. L'heure de fin de l'UIH était le moment où Tcore est revenu à 34 ° C. La durée totale de l'UIH a ensuite été définie comme la période de temps allant du début à la fin de l'UIH. Un ECG a été enregistré à l'aide du système ECGenie (Mouse Specifics) chez des souris éveillées. La fréquence cardiaque a été analysée à l'aide du logiciel d'analyse de signal EzCG (v.7.0, Mouse Specifics). Pour tester l'effet UIH à différentes températures ambiantes, nous avons réglé la température dans le système CLAMS pour qu'elle soit maintenue à ~6 °C, ~22 °C ou ~30 °C. Les souris ont d'abord été adaptées au CLAMS à la température ambiante prédéfinie pendant 1 jour avant l'expérience. Suite à l'adaptation, une stimulation US a été délivrée aux souris en utilisant le même protocole décrit précédemment lorsque les souris étaient à la température ambiante spécifique (6 ° C, 22 ° C ou 30 ° C).

L'augmentation de la température cérébrale induite par les États-Unis a été mesurée par thermométrie MR in vivo à l'aide d'un scanner 4.7T MR (Agilent/Varian DirectDrive Console) en utilisant la méthode similaire décrite dans l'article précédent34. Les images de phase ont été acquises à l'aide d'une séquence d'imagerie à écho de gradient appliquée en continu avec un angle de retournement de 20 °, un TR de 10 ms et un TE de 4 ms, une épaisseur de tranche de 1, 5 mm et une taille de matrice de 128 × 128 pour un champ de vision de 60 × 60 mm. Les images de phase ont été traitées en temps réel à l'aide du logiciel ThermoGuide (v.1.3.4, Image Guided Therapy) pour produire les images de température basées sur la méthode de décalage de fréquence de résonance des protons. L'élévation de température à l'intérieur de la sonde du transducteur américain a été mesurée à l'aide d'un thermomètre à fibre optique (Luxtron, maintenant LumaSense Technologies). Le thermomètre à fibre optique a été inséré dans le cône du transducteur américain et placé au-dessus de la tête de la souris et sous le matériau piézoélectrique pour mesurer l'élévation de température de la sonde du transducteur.

Le système de contrôle de rétroaction a été développé à l'aide d'un contrôleur de rétroaction (MATLAB et un microcontrôleur Arduino UNO R3 open source), un élément de détection (le capteur de température corporelle de télémétrie) et un dispositif d'actionnement (US). Le concept du système de contrôle de rétroaction en boucle fermée est illustré à la Fig. 3. Le système de contrôle de rétroaction a reçu en continu des mesures de Tcore à des intervalles de 1 minute. Lorsque le Tcore > Tset détecté (Tset = 34 °C), le système a activé les États-Unis (pression acoustique négative maximale de 1,6 MPa ; rapport cyclique de 50 % ; fréquence de répétition des impulsions de 10 Hz ; durée du stimulus de 10 s ; intervalle inter-stimulus de 20 s ; nombre de stimulus de 6). Lorsque Tcore ≤ Tset, les États-Unis étaient désactivés. Comme les souris devaient porter le transducteur américain pendant une longue durée, nous avons conçu un connecteur de câble à joint rotatif spécial modifié à partir d'une bague collectrice rotative à 360° (Adafruit) pour permettre au câble du transducteur américain de tourner librement lorsque la souris se déplaçait. La durée totale d'enregistrement était de 30 h et les souris ont reçu une stimulation US contrôlée par rétroaction pendant 24 h. L'eau et la nourriture étaient librement accessibles aux souris. Pour compenser l'atténuation acoustique supplémentaire résultant de la formation de bulles dans le gel américain après de multiples stimulations, la pression acoustique a été augmentée de 10 % et le nombre de stimulus a été augmenté à 8 après 12 h de stimulation. Les poids des souris et de la nourriture dans la cage ont été mesurés avant et après l'expérience.

Les activités neuronales évoquées par les États-Unis dans les régions POA et DMH ont été étudiées par enregistrement photométrique sur fibre des signaux GCaMP. Un mois avant l'enregistrement, AAV5-Syn-GCaMP6s a été injecté dans la région POA ou DMH par injection stéréotaxique en utilisant des coordonnées déterminées selon le Mouse Brain Atlas : DV = -5,0 mm, AP = 0,2 mm et ML = 0,2 mm pour la POA ; DV = −5,2 mm, AP = −1,8 mm et ML = 0,2 mm pour le DMH. Pour l'enregistrement au POA, la plaque de base du transducteur américain a été fixée au crâne de la souris avec son trou central aligné avec le trou percé lors de l'injection du virus. Une canule à fibre optique (MFC_200/245-0.37_6mm_ZF1.25_FLT, Doric Lenses) a été implantée à environ 200 µm au-dessus du site d'injection à travers le trou de la plaque de base et le trou a été foré pendant l'injection du virus. Cette conception a permis l'alignement de la région focale américaine et de la pointe de la canule dans le POA. Pour l'enregistrement au DMH, une plaque de base avec un trou à 2 mm décentré a été implantée et la canule a été insérée à travers ce trou dans le cerveau. Cette conception de plaque a permis une stimulation US à travers le centre de la plaque qui était alignée avec le POA, tandis que l'enregistrement photométrique se faisait dans la région DMH. La canule et la plaque de base ont ensuite été fixées et stabilisées par du ciment adhésif. Les souris ont ensuite été autorisées à récupérer de la chirurgie pendant 1 semaine.

Des transducteurs US portables pour une stimulation US simultanée et un enregistrement de photométrie par fibre ont été construits en forant un trou de 2 mm de diamètre pour insérer la fibre optique. Le trou était situé au centre du transducteur pour cibler le POA et à 2 mm décentré pour cibler le DMH. Le transducteur était branché sur la plaque de base. Un manchon d'accouplement a été passé à travers le trou du transducteur et a relié la virole en acier inoxydable à la canule implantée. La fibre transmettait de la lumière bleue excitatrice (longueur d'onde de 470 nm, puissance de 4 %) et collectait les photons émis par GCaMP6s. Les signaux GCaMP6s ont été collectés, numérisés et mesurés avec un système de photométrie (FP3002, Neurophotometrics) en synchronisation avec la stimulation US. Un logiciel open-source Bonsai (v.2.7) a été utilisé pour acquérir les données de photométrie et le signal de synchronisation d'une LED.

Les données de photométrie ont été acquises avant, pendant et après la stimulation US. Les données acquises ont été traitées à l'aide d'une méthode adaptée d'une méthode rapportée précédemment56. Les données ont d'abord été décolorées à l'aide d'un filtre passe-haut et converties en score z à l'aide de la fonction 'zscore' de MATLAB. Les pics ont été identifiés à l'aide de la fonction 'findpeaks' de MATLAB. L'amplitude maximale, la moyenne du score z et la fréquence maximale ont été calculées avant l'US (la période de 5 s juste avant la stimulation US), pendant l'US (10 s pendant la stimulation US) et après l'US (la période de 15 s juste après la fin de la stimulation US). Le temps d'apparition de l'activation neurale a été déterminé comme le temps entre le début de l'US et le début d'une activité Ca2+ évoquée avec succès qui a été définie comme le score z> (moyenne + 3 × sd) de celui avant l'US.

De plus, pour vérifier les positions du transducteur américain et de la fibre optique, une IRM des souris a été réalisée à l'aide d'un scanner IRM pour petits animaux de 9,4 T (BioSpec 94/20 USR ; Bruker BioSpin MRI, Ettlingen). Les souris ont été anesthésiées sous 2% d'isoflurane et placées dans une bobine de volume RF (Bruker BioSpin MRI). Les images d'écho de spin rapide pondérées en T2 ont été acquises en utilisant les paramètres suivants : TR/TE de 2 200/43,53 ms ; épaisseur de tranche de 0,25 mm ; résolution dans le plan de 0,125 × 0,125 mm2 ; taille de matrice de 256 × 256 ; angle de retournement de 180° ; moyennes de 8.

Environ 1,5 h après la stimulation américaine, les souris ont été tuées par perfusion transcardiaque avec du PBS suivi de 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Les cerveaux ont été collectés et fixés dans du PFA à 4% pendant la nuit et équilibrés dans du saccharose à 30% (dans du PBS 1 ×) pour la cryosection. Les cerveaux fixés ont été sectionnés en tranches de 15 µm pour la coloration immunohistochimique et l'analyse d'hybridation in situ.

La coloration immunohistochimique a été réalisée à l'aide des anticorps primaires suivants : anti-NeuN (Abcam, n° cat. 104225, dilution 1:1000), anti-GFAP (Abcam, n° cat. 207165, dilution 1:1000), anti-Iba1 (Abcam, n° cat. 178846, dilution 1:1000) et anticorps anti-c-Fos (Cell Signaling Technology , n° de catalogue 2250, dilution 1:500). La coloration FISH à l'aide du test RNA-scope a été réalisée en suivant le protocole du fabricant pour le kit RNA-scope Multiplex Fluorescent v2 (Advanced Cell Diagnostics (ACD), 323110). Les sondes RNA-scope utilisées étaient Mm-FOS (ACD, 316921), Mm-Adcyap1-C2 (ACD, 405911-C2) et Mm-Trpm2-C3 (ACD, 316831-C3).

Les tranches de cerveau colorées ont été imagées à l'aide du microscope multicanal Keyence BZ-X800 avec un objectif × 20 et du logiciel BZ-X800 Analyzer (Keyence Corp). Pour quantifier le pourcentage de cellules positives sur différentes régions du cerveau, les tranches de cerveau ont été enregistrées avec l'Allen Brain Atlas sur la base d'une méthode d'enregistrement semi-automatique dans MATLAB rapportée précédemment57. L'intensité de fluorescence moyenne des marqueurs protéiques ou ARN a été calculée dans la zone cellulaire estimée et déterminée comme étant positive si elle était supérieure à la moyenne + 3 × sd du fond du cerveau entier.

Environ 1 h après la stimulation américaine, les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée (1 × PBS). La région POA des souris traitées aux États-Unis (US+, n = 4) et des souris fictives (US−, n = 4) a été extraite de chaque cerveau et homogénéisée dans un homogénéisateur Dounce (Kimble) contenant 0,4 ml de tampon d'extraction nucléaire fraîchement préparé (250 mM de saccharose, 25 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % de Triton X-1 00 et 0,2 U μl-1 inhibiteur de la ribonucléase recombinante (Invitrogen RNaseOUT)) en appliquant quatre coups avec le pilon A suivis de huit coups avec le pilon B. L'homogénat de quatre souris du groupe témoin et de quatre souris du groupe américain a été regroupé pour l'isolement du noyau. Les échantillons ont été filtrés à travers un tube à tamis cellulaire de 30 µm (Corning Falcon) et centrifugés à 500 g pendant 5 min à 4 ° C pour précipiter les noyaux. Les noyaux dissociés ont été lavés une fois et remis en suspension doucement avec un tampon de stockage nucléaire (PBS avec 1% de BSA et 0, 2 U μl-1 d'inhibiteur de ribonucléase recombinant). Pour purifier les noyaux des neurones pour l'ARN-seq à noyau unique, la suspension de noyaux a été incubée avec l'anticorps anti-NeuN de souris conjugué Alexa Fluor 488 (Millipore sigma, MAB377X, dilution 1:200) pendant 30 min sur de la glace. Après incubation, les noyaux ont été lavés une fois et remis en suspension avec un tampon de stockage nucléaire avec 1 μg ml-1 DAPI. Les échantillons ont été filtrés à travers un tube à tamis cellulaire de 30 µm et triés brièvement à l'aide de FACS (MoFlo, Beckman Coulter) à l'aide du logiciel FlowJo (v.10.8) avec une stratégie de déclenchement spécifique (Fig. 1 supplémentaire). Les noyaux neuronaux ont été triés sur noyaux DAPI+/NeuN+ et collectés dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. Environ 25 000 noyaux de neurones ont été collectés dans chacun des groupes de contrôle et des États-Unis et envoyés à GTAC@MGI pour un ARN-seq unicellulaire (10x Genomics). À l'aide d'un kit Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ GEM, Library and Gel Bead v.3.1 (10x Genomics), les noyaux de neurones ont été immédiatement chargés sur un processeur Chromium Single Cell (10x Genomics) pour le codage à barres d'ARN à partir de noyaux uniques. Les bibliothèques de séquençage ont été construites selon les instructions du fabricant et les échantillons d'ADNc résultants ont été analysés sur un bioanalyseur Agilent en utilisant la puce à ADN haute sensibilité pour déterminer les concentrations d'ADNc. Les échantillons ont été combinés et exécutés sur un Illumina Nova Seq 6000.

Les données de séquençage brutes ont été traitées à l'aide du pipeline 10x Genomics CellRanger (v.6.1.1) basé sur le génome de souris de référence (mm10-2020-A) avec des paramètres par défaut. Les données ont été normalisées à l'échantillon saturé le plus bas, conduisant à 83 113 lectures (moyenne), 3 207 gènes (médiane) et 7 353 comptes d'identifiant moléculaire unique (UMI) (médiane) par cellule dans le groupe témoin (n = 4 souris). Le groupe UIH (n = 4 souris) contenait 77 898 lectures, 2 998 gènes et 6 498 comptages UMI par cellule.

Le package Seurat (v.4.0) dans R studio (R v.4.2) a été utilisé pour traiter les données d'ARN-seq à noyau unique. Les données ont d'abord été filtrées avec les critères suivants. Les cellules qui avaient> 5% de comptes mitochondriaux ont été considérées comme présentant une contamination mitochondriale étendue et ont été filtrées. Les cellules qui avaient un nombre de caractéristiques uniques> 7 500 ont été considérées comme des doublets ou des multiples et ont été filtrées. Les cellules qui avaient un nombre de caractéristiques uniques <200 ont également été filtrées. Après filtrage, tous les objets Seurat ont été fusionnés. La méthode « LogNormalize » avec un facteur d'échelle de 10 000 a été utilisée pour la normalisation. La fonction 'FindVariableFeatures' a été utilisée pour extraire les 4 000 principales caractéristiques variables. Les données ont été mises à l'échelle en fonction du pourcentage de mitochondries à l'aide de la fonction ScaleData. Les IEG pourraient potentiellement affecter le clustering. Par conséquent, nous avons supprimé les 139 IEG58 de la liste des gènes caractéristiques avant le pipeline de traitement de données suivant. Ensuite, une analyse en composantes principales a été effectuée à l'aide de la fonction « RunPCA ». En utilisant les 40 principaux composants principaux, la fonction « The FindNeighbours » et « FindClusters » ont été utilisées pour identifier les 34 clusters initiaux. Les résultats de regroupement ont été visualisés à l'aide de parcelles UMAP.

Les grappes identifiées comme des cellules neuronales ont été utilisées pour une analyse plus approfondie en vérifiant le niveau d'expression moyen de Kif5c et Camk2a58. Un total de 21 886 sur 22 612 ont été identifiés comme des cellules neuronales. La fonction « FindAllMarkers » a été utilisée pour trouver des gènes significatifs dans chaque cluster. La population neuronale a été en outre traitée pour identifier les sous-types neuronaux en répétant les méthodes susmentionnées. Le regroupement a identifié 11 types de cellules neuronales excitatrices et 24 inhibitrices. La construction d'arbres hiérarchiques sur les neurones excitateurs a été utilisée pour identifier les neurones associés à la torpeur sur la base des caractéristiques précédemment rapportées, notamment Adcyap1, Qrfp et Esr1 (réfs. 11, 12, 15) sur la base du regroupement k-means. Les niveaux d'expression moyens des canaux ioniques TRP et PIEZO, qui ont été résumés à partir de la littérature précédente, ont été examinés dans tous les clusters associés à la torpeur.

Des particules lentivirales contenant du shRNA Trpm2 (m) (n° de catalogue sc-42675-V, Santa Cruz Biotechnology) ont été utilisées pour réduire l'expression des canaux ioniques TRPM2 et des particules lentivirales contenant du shRNA brouillé (m) (n° de catalogue sc-108080, Santa Cruz Biotechnology) ont été utilisées comme contrôle. Ensuite, une solution de shRNA de 1,5 µl (106 unités infectieuses de virus) a été microinjectée bilatéralement dans la région POA (volume total de 3 µl). L'injection a été effectuée trois fois tous les 3 jours pour assurer un nombre suffisant de particules lentivirales dans le POA. À 3 semaines après la première injection, les souris ont reçu une stimulation US au niveau de la région POA comme décrit précédemment. Western blot a été réalisé pour évaluer le niveau d'expression de TRPM2 dans la région POA dans le groupe knockdown et comparé à celui du groupe témoin injecté avec du shRNA brouillé.

Pour examiner la sensibilité américaine du canal ionique TRPM2, nous avons utilisé notre méthode d'imagerie calcique in vitro rapportée précédemment34. Les cellules HEK293T (CRL-3216, ATCC) ont été cultivées dans du DMEM (4,5 g l-1 de glucose), additionné de 10 % de FBS, 2 mM de l-glutamine, 100 μg ml-1 de pyruvate de sodium, 1 % d'acides aminés non essentiels et 1 % de pen-strep. Le canal ionique TRPM2 a été surexprimé dans les cellules à l'aide de Lipofectamine 2000. Un jour avant la transfection, des cellules à 0, 5–1 × 105 dans un milieu de croissance de 500 μl sans antibiotiques ont été ensemencées dans une plaque à 48 puits dans un puits sur deux. Ensuite, 2 µl de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) ont d'abord été mélangés avec 0,8 µg de plasmide d'ADN Trpm2 (plasmide 53920, Addgene) dans 50 µl d'Opt-MEM. Ensuite, 50 μl du complexe ont été ajoutés aux cellules pour permettre une transfection de 2 jours avant d'appliquer la stimulation US. Fluo-4 AM (Thermo Fisher Scientific), un indicateur de Ca2+, a été utilisé pour imager la dynamique spatiale de la réponse du Ca2+ à la stimulation américaine à l'aide d'un microscope à fluorescence à une fréquence d'images de 2,4 images s−1 avec le logiciel Q-capture (pro 7). L'expression fonctionnelle de TRPM2 a été validée par l'observation du signal Ca2+ en réponse à l'agoniste ADPR (concentration finale 100 μM, adénosine 5'-diphosphoribose sel de sodium, A0752-25MG, Sigma-Aldrich). 30 s après le début de l'enregistrement, une stimulation US (fréquence de 1,7 MHz, pression acoustique de 1,0 MPa, rapport cyclique de 40 %, PRF de 10 Hz, durée de 60 s) a été appliquée aux cellules en utilisant la configuration de stimulation US personnalisée telle que décrite dans notre étude précédente34. Nous n'avons pas utilisé le même paramètre US que le protocole de stimulation US in vivo en raison de la différence entre les transducteurs US. Le temps de début de l'activation des cellules TRPM2 + a été défini comme le temps entre le début de l'US et le début d'une activité Ca2 + évoquée avec succès, qui a été défini comme ΔF / F> (moyenne + 3 × sd) du signal avant la stimulation US. La température de la chambre de culture cellulaire a été contrôlée à l'aide d'un thermomètre à fibre optique. La pointe du thermomètre à fibre optique a été insérée à environ 1 mm près du foyer du transducteur pour éviter l'interférence de la propagation des ondes américaines. Pour l'étude du bloqueur, 5 µl d'antagoniste 2-APB (TOCRIS) ont été ajoutés à 500 µl de solution de culture cellulaire à une concentration finale de 30 µM 1 min avant la stimulation US.

L'analyse statistique a été effectuée dans GraphPad (Prism) et les méthodes d'analyse statistique sont notées dans chaque légende de figure. Les différences statistiques ont été considérées comme significatives chaque fois que P < 0,05.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données présentées dans cette étude sont disponibles dans les données Source. Les ensembles de données originaux utilisés dans l'analyse de séquençage d'ARN à noyau unique sont accessibles au NCBI, archivés sous le code d'accès Gene Expression Omnibus GSE228180. L'atlas du cerveau des souris utilisé dans cette étude est disponible dans l'Atlas du cerveau Allen. Des informations supplémentaires et des demandes de ressources et de réactifs qui appuient les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions JD Quirk pour son aide concernant le problème technique du scanner IRM. Nous remercions L. Li de l'Université de Washington, C.-K. Mo et X. Liu pour nous avoir fourni des suggestions précieuses sur l'analyse des données d'ARN-seq à noyau unique. Nous remercions également A. Norris et A. Cone de nous avoir aidés à configurer l'imagerie de la température corporelle à l'aide d'une caméra thermique. Nous remercions M. Rhodes pour son aide à l'imagerie des tranches colorées au FISH. Certains des dessins animés ont été créés avec BioRender.com. Ce travail a été soutenu par le NIH R01MH116981 (HC), UG3MH126861 (HC), R01EB027223 (HC) et R01EB030102 (HC). JRB est soutenu par NIH DP5 OD028125 et Burroughs Wellcome Fund CAMS no. 1019648.

Département de génie biomédical, Université de Washington à St. Louis, Saint Louis, MO, États-Unis

Yaoheng Yang, Jinyun Yuan, Dezhuang Ye, Zhongtao Hu, Kevin Xu, Lu Xu, Yan Gong, Yimei Yue, Jianmin Cui et Hong Chen

Département de pathologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Washington, Saint Louis, MO, États-Unis

Rachael L. Field et Jonathan R. Brestoff

Département de psychiatrie, École de médecine de l'Université de Washington, Saint Louis, MO, États-Unis

Alexxai V. Kravitz

Départements d'anesthésiologie et de médecine de la douleur, de pharmacologie et de bio-ingénierie, Centre de neurobiologie de la toxicomanie, de la douleur et des émotions, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Michel R. Bruchas

Département de radio-oncologie, École de médecine de l'Université de Washington, Saint Louis, MO, États-Unis

Hong Chen

Département de neurochirurgie, École de médecine de l'Université de Washington, St. Louis, MO, États-Unis

Hong Chen

Division de neurotechnologie, École de médecine de l'Université de Washington, Saint Louis, MO, États-Unis

Hong Chen

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La conceptualisation était la responsabilité de HC et Y. Yang. La conception de l'expérience était de la responsabilité de HC, Y. Yang, JRB et MRB La mise en œuvre de l'expérience était de la responsabilité de Y. Yang, JY, RLF, DY, ZH, LX, KX, Y. Yue et YG L'étude des résultats était de la responsabilité de HC, Y. Yang, JY, AVK, MRB et JRB La visualisation a été effectuée par HC et Y. Yang. L'acquisition du financement était de la responsabilité de HC L'administration du projet a été réalisée par HC La supervision a été réalisée par HC, JRB, MRB et JC La rédaction du projet original a été réalisée par HC et Y. Yang. La révision et l'édition ont été effectuées par HC, Y. Yang, JC, JY, RLF, DY, ZH, YG, KX, AVK, MRB et JRB

Correspondance à Hong Chen.

JRB a des demandes de brevet en attente qui ne sont pas liées à l'étude en cours. Plus précisément, ils concernent le transfert de mitochondries pour le traitement de maladies associées à un dysfonctionnement mitochondrial, une approche thérapeutique pour les maladies allergiques et un procédé pour surmonter les effets de crochet dans les immunodosages. JRB a été consultant pour DeciBio et Flagship Pioneering au cours des 12 derniers mois et siège au conseil consultatif scientifique de LUCA Science. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Metabolism remercie Gerhard Heldmaier, Martin Jastroch, Takeshi Sakurai et Elsa Fouragnan pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation primaire : Christoph Schmitt, en collaboration avec l'équipe de Nature Metabolism.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

(A) Illustration du transducteur à ultrasons portable. Le transducteur était attaché à une plaque de base collée sur la tête de la souris. Photos de la sonde à ultrasons (sonde US) et de la plaque de base. Une photo de l'insert de la plaque de base est également fournie. L'insert de la plaque de base avec un trou au centre a été utilisé lors de l'installation de la plaque de base pour guider le positionnement de la plaque de base. L'insert a été retiré après l'installation de la plaque de base. (B) Le montage expérimental pour mesurer les champs de pression acoustique générés par la sonde à ultrasons à l'aide d'un hydrophone dans un réservoir d'eau dégazée. Le crâne de souris ex vivo avec la plaque de base a été placé devant la sonde à ultrasons. (C) Les champs de pression acoustique mesurés dans le plan focal axial et le plan focal latéral en présence du crâne de la souris. La taille de la région focale mesurée par la pleine largeur à mi-hauteur était de 3,8 mm dans la direction axiale et de 0,8 mm dans la direction latérale.

(A) Changement de température corporelle centrale induit par l'UIH (max ΔTcore) et changement du taux métabolique (max ΔVO2) chez les souris femelles (roses) et mâles (bleues). Dans le graphique de gauche, n = 6 souris mâles dans les groupes US+ et US− et n = 7 souris femelles dans le groupe US+ et 8 souris femelles dans le groupe US−. Dans le graphique de droite, n = 5 souris dans tous les groupes. (B) Corrélation temporelle de VO2 et Tcore induite par la stimulation par ultrasons. La sonication US est indiquée par la barre rose. (C) Comparaison du temps d'apparition de VO2 et de Tcore. N = 7 souris. (D) Quantification de la durée de l'état hypothermique. N = 7 souris. (E) Quantification du temps de réchauffement (du Tcore le plus bas à 34 ° C) dans les groupes recevant une stimulation US unique et recevant une stimulation ultrasonore contrôlée par rétroaction de longue durée. N = 7 souris pour le groupe de stimulation US unique et 4 souris pour le groupe de stimulation par ultrasons à rétroaction contrôlée. Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié en (A et E) et d'un test t bilatéral apparié en C.

Données source

Changement de la température corporelle centrale par rapport à la ligne de base (ΔTcore) et le ΔTcore max calculé pour les quatre groupes, y compris le groupe sans stimulation par ultrasons (US−), le groupe recevant une stimulation par ultrasons au POA (POA), le groupe témoin hors cible recevant des ultrasons au niveau du cortex (Cortex) et le groupe témoin hors cible recevant des ultrasons au niveau de l'hippocampe ventral (Hippocampe). Dans la figure de droite, le ΔTcore max a été calculé comme le Tcore le plus bas - le Tcore moyen avant US. La sonication US est indiquée par la barre rose. Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris. N = 8 souris dans le groupe US, 7 souris dans le groupe POA, 4 souris dans le groupe Cortex et 6 souris dans le groupe Hippocampus. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Dunnett comparant chaque groupe à l'US−.

Données source

Évaluation de la morphologie et du nombre de neurones, d'astrocytes et de microglie après stimulation par ultrasons au POA. Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris. N = 5 souris. Les valeurs P ont été calculées à l'aide du test t bilatéral non apparié.

Données source

(A) Température corporelle centrale (Tcore) et (B) taux métabolique (VO2) pour les souris recevant une stimulation par ultrasons à différentes températures ambiantes (6 oC, 22 oC et 30 oC). La sonication US est indiquée par les barres roses. Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris. Max ΔTcore et max VO2 ont été calculés en calculant la différence entre la valeur minimale obtenue dans la période de 70 min suivant le début de l'échographie et la valeur de référence qui a été définie comme la température corporelle moyenne de la fenêtre de 5 min survenant 1 minute avant la stimulation par ultrasons. N = 4 souris pour tous les groupes. Les valeurs P ont été calculées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Dunnett par rapport au groupe à température ambiante de 22 °C.

Données source

Gauche : Coloration par immunofluorescence de la protéine c-Fos dans le cerveau stimulé par ultrasons (US+) et le cerveau non soniqué (US−). Droite : Pourcentage de cellules c-Fos+ parmi toutes les cellules de la région POA ciblée lors de la comparaison des groupes US+ et US−. N = 5 souris pour le groupe US+ et 4 souris pour le groupe US-. Les barres d'erreur indiquent que les valeurs sem P ont été calculées à l'aide de tests t bilatéraux non appariés.

Données source

Évaluation par Western blot du niveau d'expression de TRPM2 chez des souris fictives recevant l'injection de virus témoin (Sham) et des souris recevant une injection de Lentivirus-Sh-ARN pour renverser l'expression de TRPM2 (TRPM2-KD). Les barres d'erreur indiquent sem N = 4 souris pour le groupe TRPM2-KD et 5 souris pour le groupe Sham. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t bilatéraux non appariés.

Données source

Quantification du taux de changement de température corporelle (taux de pic ΔTcore) et du taux de changement de VO2 (taux de pic ΔVO2) lors de l'entrée (A) et de l'éveil de l'UIH (B) pour les groupes WT et UCP1-KO. Les barres d'erreur indiquent sem Chaque point représente une souris (femelle). N = 6 souris pour le groupe WT et 5 souris pour le groupe UCP1-KO. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de tests t bilatéraux non appariés.

Données source

(A) (Gauche) Image de thermométrie MR vue coronale du chauffage induit par les ultrasons dans le cerveau de la souris in vivo. La ligne blanche continue décrit le cerveau de la souris et les lignes pointillées illustrent le faisceau d'ultrasons. (À droite) Changements de température dans la région POA ciblée par ultrasons (ΔTTarget) en fonction du temps. (B) (Gauche) Le temps d'apparition de l'activation neurale a été calculé à partir de l'enregistrement photométrique par fibre de l'activité Ca2+ au POA pendant la stimulation américaine (Fig. 4). (À droite) Le ΔTTarget correspondant au début de l'activation neurale. Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem Chaque point représente une stimulation ultrasonore de 10 s.

Données source

(A) Changements de température dans la chambre de culture cellulaire (ΔTchamber) en fonction du temps. (B) (à gauche) Le temps d'apparition de l'activation des cellules TRPM2 + a été calculé à partir des images de fluorescence Ca2 + de cellules HEK293 in vitro avec surexpression de TRPM2 (Fig. 6). (À droite) La chambre ΔT correspondante au début de l'activation de TRPM2. Les lignes pleines et les ombres indiquent la moyenne ± sem Chaque point représente une cellule.

Données source

Stratégie de synchronisation de cytométrie en flux.

Vidéo d'imagerie thermique infrarouge représentative d'une souris recevant une stimulation ultrasonore non invasive au POA.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Western blots non traités.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

Données de source statistique.

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Réimpressions et autorisations

Yang, Y., Yuan, J., Field, RL et al. Induction d'un état hypothermique et hypométabolique de type torpeur chez les rongeurs par ultrasons. Nat Metab 5, 789–803 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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Reçu : 29 octobre 2022

Accepté : 11 avril 2023

Publié: 25 mai 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42255-023-00804-z

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Métabolisme naturel (2023)