Atlas de la traduction et de la décomposition de l'ARNm pour les bactéries

Nature Microbiology volume 8, pages 1123–1136 (2023)Citer cet article

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La régulation de la stabilité de l'ARN messager est essentielle pour l'expression programmée des gènes dans les bactéries et est réalisée par une myriade de mécanismes moléculaires. Par séquençage en masse d'intermédiaires de désintégration de l'ARNm monophosphorylé en 5 '(5'P), nous montrons que la dégradation cotraductionnelle de l'ARNm est conservée chez les bactéries Gram-positives et négatives. Nous démontrons que, chez les espèces avec des exonucléases 5′–3′, l'exoribonucléase RNase J suit le ribosome arrière pour produire une empreinte in vivo à un seul nucléotide de la position 5 'du ribosome. Chez d'autres espèces dépourvues d'exonucléases 5′–3′, le positionnement des ribosomes modifie les sites de clivage endonucléolytique. En utilisant notre approche de séquençage métadégradome (dégradome 5′P), nous caractérisons les intermédiaires de décomposition de l'ARNm 5′P chez 96 espèces, dont Bacillus subtilis, Escherichia coli, Synechocystis spp. et Prevotella copri et identifier les réponses de blocage des ribosomes au niveau des codons et des gènes au stress et au traitement médicamenteux. Nous appliquons également le séquençage 5′P à des microbiomes cliniques et environnementaux complexes et démontrons que le séquençage métadégradome fournit une caractérisation post-transcriptionnelle rapide et spécifique à l'espèce des réponses aux perturbations médicamenteuses ou environnementales. Enfin, nous produisons un atlas degradome pour 96 espèces afin de permettre l'analyse des mécanismes de dégradation de l'ARN chez les bactéries. Notre travail ouvre la voie à l'application du séquençage métadégradome à l'étude de la régulation post-transcriptionnelle chez les espèces incultivables et les communautés microbiennes complexes.

La dégradation et la traduction de l'ARN messager (ARNm) sont étroitement liées et les modifications de la dynamique des ribosomes modulent directement la stabilité de l'ARN messager1,2,3,4. Chez les eucaryotes, la synthèse des protéines et la dégradation de l'ARNm sont reliées par l'exonucléase 5′–3′ Xrn1, qui suit le dernier ribosome en traduction produisant une empreinte in vivo de sa position5,6. La dégradation de l'ARN dans les bactéries permet l'adaptation à des environnements changeants, mais notre compréhension de la dégradation de l'ARN dans les bactéries a été entravée par la diversité des mécanismes de dégradation de l'ARN. On pensait que la dégradation de l'ARN bactérien était initiée par clivage endonucléolytique suivi d'une dégradation 3′–5′7,8,9,10. Bien que l'activité exonucléolytique de l'ARN 5′–3′ de la RNase J chez Bacillus subtilis11 et ses homologues chez d'autres espèces9 ait été rapportée et que l'efficacité de la traduction soit connue pour moduler la stabilité de l'ARNm dans les bactéries3,12, nous ne comprenons pas comment la dégradation cotraductionnelle de l'ARNm façonne la bactérie. degradome ou si ce processus diffère chez les espèces avec des mécanismes de dégradation de l'ARNm divergents.

Pour mieux comprendre la régulation de la biologie de l'ARN chez les bactéries, nous avons étudié la dégradation de l'ARNm dans des souches bactériennes de référence et des microbiomes complexes à l'aide d'un séquençage optimisé des intermédiaires de désintégration de l'ARNm 5' monophosphorylé (5′P) (dégradome) (5PSeq). Nous avons exploré dans quelle mesure le 5′P d'origine naturelle reflète la dynamique des ribosomes in vivo et caractérisons le dégradome du 5′P en réponse au stress environnemental et au traitement médicamenteux dans des souches de référence et des cultures fécales complexes. Nous avons analysé les modèles de dégradation de l'ARNm dans 96 espèces cultivables et incultivables, y compris l'organisme modèle B. subtilis, et rapportons nos résultats ici.

Nous avons analysé le dégradé d'ARNm 5′P dans des espèces individuelles et des communautés bactériennes complexes à l'aide de 5PSeq optimisé) 5, 13, 14, 15 (tableaux supplémentaires 1 et 2 et méthodes). Nous avons d'abord étudié le dégradé 5′P des cadres de lecture ouverts (ORF) chez les espèces présentant une désintégration 5′–3′. B. subtilis code pour l'exonucléase 5′–3′ RNase J11. Bien que la RNase J ne soit pas homologue à la XRN1 eucaryote, nous avons émis l'hypothèse que, via son activité exonucléase 5′–3′, elle pourrait «chasser» le dernier ribosome de traduction dans les ARNm subissant une désintégration cotraductionnelle, similaire à XRN1 chez la levure5,16. Notre analyse a révélé une périodicité de 3 nucléotides (nt) des comptages de 5′P (Fig. 1a) avec une préférence de 5′P pour le deuxième nucléotide de chaque codon (F1), à la fois au niveau du métagène et du gène unique (Fig. 1a et Données étendues Fig. 1a). Les intermédiaires de dégradation du 5′P accumulent respectivement 11 et 14 nt en amont des sites de début et d'arrêt de la traduction, comme prévu pour les ribosomes à initiation et à terminaison lentes. Ce modèle est analogue aux sites -14 nt depuis le début et -17 nt depuis l'arrêt de la levure bourgeonnante5,15. Cette taille de protection inférieure de 3 nt peut s'expliquer par la différence connue dans la taille des ribosomes entre les eucaryotes et les bactéries17. Nous avons confirmé l'association d'intermédiaires de désintégration 5′P avec des ribosomes en traduction par l'application de 5PSeq à des fractions polyribosomales de gradients de densité de saccharose et avons observé des schémas similaires (Extended Data Fig. 1b). Pour démontrer son origine biologique, nous avons confirmé que la fragmentation in vitro du même ARN éliminait la périodicité de 3 nt observée in vivo de> 99, 5% (signal de transformée de Fourier rapide (FFT) tombant à 0, 11) et par les empreintes de pied associées au démarrage / arrêt (Fig. .1a). Enfin, pour déterminer s'il existe un rôle pour la RNase J dans ce processus, nous avons répété l'analyse dans une souche de suppression de la RNase JA de B. subtilis (rnjA). Cela a révélé que l'activité de la RNase JA sous-tend le schéma de distribution 5'P observé résultant de la dégradation cotraductionnelle de l'ARNm (Fig. 1b).

a, Metacounts (5PSeq lectures par million (RPM)) des positions de cartographie 5' par rapport aux sites d'initiation et de terminaison de la traduction des ORF de B. subtilis. Aucun contrôle de traitement (NT) (vert), traité par CAM (jaune) et fragmenté au hasard (en rouge) sont affichés. Les RNases identifiées sont mises en surbrillance dans le coin supérieur droit (celles non identifiées sont colorées en gris clair). Les positions 5PSeq originales sont rapportées (aucune correction du site P n'a été appliquée). La FFT pour la périodicité observée et un histogramme illustrant la protection relative de la trame 5PSeq pour tous les codons sont également présentés. b, métacompte 5′P pour la souche ∆rnjA, comme dans a. c, Préférence du motif de clivage sur les sites 5′P et ± quatre bases pour les espèces représentatives des phyla Bacillota, Cyanobacteria, Pseudomonadota et Bacteroidota, calculée avec la mesure basée sur l'entropie de Shannon de la contribution des nucléotides telle qu'implémentée dans le package R ggseqlogo64. A droite, la présence de RNases identifiées dans chaque espèce est mise en évidence. RNE/G (protéines de la famille des ribonucléases E/G) indique la présence du domaine catalytique conservé entre les deux ribonucléases. EPA, sites de liaison d'ARNt E, P et A sur le ribosome.

Ensuite, nous avons étudié les espèces avec ou sans exonucléases d'ARN 5'–3' annotées dans leur génome (Extended Data Fig. 2)9 pour évaluer le rôle d'autres nucléases dans la dégradation de l'ARNm. Tout d'abord, nous avons testé Bacillota (Bacillus amyloloquefaciens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri), Cyanobacteria (Synechocystis sp. PCC 6803) et Pseudomonadota (Caulobacter crescentus), qui codent tous pour la RNase J. Nous avons observé un schéma de périodicité clair de 3 nt sur toute la longueur régions codantes, avec des lectures 5′P s'accumulant fréquemment au niveau du deuxième nucléotide (F1) de chaque codon et 11 et 14 nt en amont des codons de départ et d'arrêt, respectivement (Extended Data Fig. 2), comme observé pour B. subtilis (Fig. .1a). Fait intéressant, chez Synechocystis sp. PCC 6803, le motif de protection du ribosome a été déplacé d'un nucléotide supplémentaire (c'est-à-dire une accumulation à -12 nt du début et à -15 nt des codons d'arrêt) (Extended Data Fig. 2d). Cela pourrait s'expliquer soit par une taille ou une conformation différente de la protection des ribosomes, soit par la présence de cofacteurs potentiels18,19. Nous avons également testé des espèces de Pseudomonadota, notamment Escherichia coli (DH5α et MG1655) et des Bacteroidota anaérobies (Alistipes finegoldii, Prevotella copri, Prevotella timonensis et Parabacteroides merdae), dont aucune n'a d'activité exonucléase 5'–3'. Nous avons observé un schéma de périodicité de 3 nt chez les Bacteroidota étudiés, qui ont des homologues de la famille des protéines RNE/G (RNE/G)20 et de la RNase Y. Chez E. coli, qui a la RNase E plutôt que la RNase Y, nous avons observé une subtile périodicité de 3 nt (Extended Data Fig. 2f) qui était moins perceptible dans la souche MG1655, où moins de lectures 5'P s'accumulent dans la région codante (Extended Data Fig. 2g). Contrairement aux espèces avec une exonucléase 5'–3', celles dépourvues de RNase J accumulent des sites endonucléolytiques 5′P autour des codons de départ et d'arrêt. De plus, nous avons observé un clivage 5′P chevauchant le codon d'initiation lui-même chez la plupart des espèces et différent de la protection ribosomique attendue à 11 nt en amont. Le clivage associé au codon d'initiation était particulièrement net chez C. crescentus. Nous proposons qu'il existe une relation entre l'initiation de la traduction et la désintégration de l'ARNm, où des clivages endonucléolytiques se produisent souvent au niveau des codons de départ (Extended Data Fig. 2).

La périodicité de 3 nt observée pourrait provenir d'une empreinte in vivo sur un seul nucléotide 5'–3' de la position du ribosome, comme indiqué chez les eucaryotes5. Alternativement, cela pourrait être une conséquence de l'interaction entre les préférences de clivage spécifiques à l'endonucléase, l'accessibilité différentielle de l'ARNm et la distribution non aléatoire des nucléotides le long des régions codantes. Des travaux antérieurs ont étudié la préférence de séquence de la RNase E21,22 et de la RNase Y23,24 chez des espèces sélectionnées, nous avons donc choisi d'inclure un ensemble diversifié d'espèces avec différentes machines de dégradation de l'ARN pour élargir la portée des espèces couvertes (Fig. 1c). La présence de RNase J et E sans Y chez Synechocystis sp.25 et C. crescentus est associée à des intermédiaires de dégradation de l'ARNm 5'P avec une préférence pour un A précédé d'un U (–1 U/+1 A). La présence d'homologues de protéines RNase Y et RNE / G chez Bacteroidota suggère une préférence pour +1 A. Chez Bacillota, où l'activité exonucléolytique 5'–3' domine, les intermédiaires de dégradation de l'ARNm 5'P présentent des motifs de séquence plus homogènes. Il est possible que la RNase J coupe les sites de clivage générés par endonucléolyse. Conformément à cette hypothèse, une préférence 5′P pour A émerge dans le mutant de délétion B. subtilis rnjA (Extended Data Fig. 3a), similaire à Bacteroidota où l'endonucléase RNase Y est le principal moteur de la dégradation de l'ARN (Fig. 1c) 26 ,27. Nous avons testé l'effet des délétions de la RNase JB (rnjB) et de la RNase Y (rny) chez B. subtilis et avons constaté que leur contribution au schéma observé était minime (Extended Data Fig. 3a). Fait intéressant, lors de l'exécution de la même analyse après un choc thermique (HS), nous avons observé une nette augmentation de la préférence +1 G dans tous les échantillons (Extended Data Fig. 3b). Cela suggère que l'interaction entre les RNases et la position ribosomique est dynamique et qu'elle peut être modifiée en réponse aux défis environnementaux. Nous avons également testé si l'expression hétérologue de Streptococcus pyogenes rnjA était suffisante pour modifier le profil endonucléolytique observé chez E. coli. Cependant, même lorsque rnjA était exprimé au niveau de l'ARNm tel que mesuré par 5PSeq, le schéma (–1 U / + 1 A / + 3 G) était maintenu (Extended Data Fig. 3c), ce qui suggère que l'activité de la RNase E domine toujours la dégradation de l'ARNm. Pour confirmer que les modèles observés sont causés par des mécanismes biologiques, nous démontrons une perte de préférence 5′P suite à la fragmentation in vitro de l'ARN dans des échantillons de B. subtilis et E. coli (données étendues Fig. 3a, c). Nous concluons que la préférence de séquence des intermédiaires de dégradation de l'ARNm 5′P naturellement présents est conservée dans toutes les espèces phylogénétiquement apparentées et est façonnée par la diaphonie entre les voies de dégradation de l'ARN.

Pour étudier comment les ribosomes affectent la distribution du 5′P, nous avons perturbé la dynamique des ribosomes à l'aide de chloramphénicol (CAM). Lorsque les ribosomes ont calé à l'allongement, nous avons observé une augmentation du schéma de protection des ribosomes de 3 nt chez B. subtilis, L. plantarum, L. reuteri et B. amyloliquefaciens (Fig. 1a et Extended Data Fig. 2a, c). Nous avons également observé un excès relatif d'intermédiaires de dégradation du 5'P autour des régions 5' des ORF et une diminution de la protection autour des régions 3', compatible avec une inhibition spécifique de l'allongement de la traduction plutôt qu'avec l'initiation ou la terminaison17. L'accumulation de 5′P dans les régions 5′ des ORF était également évidente chez les espèces sans activité exonucléase 5'–3', dans lesquelles on ne peut pas s'attendre à ce que l'activité endonucléolytique fournisse des informations sur la résolution d'un seul nucléotide concernant la position du ribosome (Extended Data Fig. 2f– k). Nos résultats suggèrent que le blocage des ribosomes après le traitement CAM peut limiter l'accessibilité in vivo des endonucléases et affecter le dégradome de l'ARNm 5′P. Ensuite, nous avons examiné si l'abondance des intermédiaires de désintégration de l'ARNm 5'P pouvait servir de proxy pour les pauses ribosomiques spécifiques aux codons chez les espèces contenant de la RNase J. En alignant les lectures 5'P sur chaque acide aminé respectif, nous avons généré un métagène spécifique à l'acide aminé. profils (Fig. 2 et données étendues Fig. 4). Chez L. plantarum, cela a montré une nette accumulation de 5′P associée à des ribosomes lents au niveau des codons stop et Cys, probablement associée à une disponibilité limitée de Cys libre dans le milieu de croissance (Fig. 2a) 28,29. Ensuite, nous avons perturbé le processus de traduction et testé les effets sur l'accumulation de 5′P. Tout d'abord, nous avons testé notre capacité à détecter des pauses spécifiques aux codons après un traitement de 10 minutes avec la mupirocine (MUP), un antibiotique ciblant l'ARNt synthétase Ile. Le traitement MUP a entraîné des blocages de ribosomes au niveau des codons Ile et une accumulation claire de 5′P lit 14 nt en amont de ceux de L. plantarum, L. reuteri et B. subtilis (blocage du site A ; Fig. 2a et données étendues Fig. 4a ). Cela suggère que les positions des ribosomes façonnent le dégradome bactérien. Ensuite, nous avons étudié les pauses spécifiques aux codons associées à un traitement CAM de 5 minutes chez B. subtillis, L. plantarum, L. reuteri et B. amyloliquefaciens (Fig. 2a, b et Extended Data Fig. 4b). En plus d'une inhibition générale de l'allongement de la traduction, la CAM conduit également à une accumulation de ribosomes spécifique au contexte30,31. À savoir, le traitement CAM d'E. coli a déjà été signalé comme augmentant le blocage des ribosomes lorsque Ala (et, moins fréquemment, Ser, Thr ou Gly) est positionné dans le site E. En utilisant 5PSeq, nous avons également identifié le blocage des ribosomes induit par CAM 8 nt en amont de Ala et Ser chez les espèces testées avec la RNase J (Fig. 2a, b et données étendues Fig. 4b). Nous concluons que les blocages de ribosomes spécifiques au contexte après le traitement CAM sont conservés dans les bactéries. De plus, nos résultats montrent que les signatures 5′P peuvent être utilisées comme rapporteurs moléculaires pour les antibiotiques qui ciblent le processus de traduction chez les espèces avec RNase J.

a–c, cartes thermiques pour la couverture d'ARN 5′P spécifique aux acides aminés, codée en couleur bleu (faible) à jaune (élevé). La distance par rapport à des acides aminés spécifiques est indiquée par le nombre de nucléotides. Les ribosomes en pause à -14 indiquent un décrochage du site A. Les acides aminés sélectionnés sont également représentés sous forme de graphiques linéaires. a, L. plantarum fait une pause après le traitement CAM (jaune) et MUP (violet) par rapport à l'échantillon témoin NT collecté à OD600 = 0,6–0,8 (OD = 0,6). b, pauses CAM spécifiques au contexte de B. subtilis induites par l'avant-dernier acide aminé (de la chaîne peptidique) montrées en position -8 (CAM, jaune). c, L. plantarum fait une pause après le traitement du stress. d,e, PCA du phénotype de protection des ribosomes (Méthodes) fait la distinction entre le stress et le traitement médicamenteux chez L. plantarum (d) et B. subtilis (e). Les groupes séparés de B. subtilis non traités peuvent s'expliquer par des différences dans leur phase de croissance à la récolte (OD600 0,2–0,3 et 0,6–0,8, respectivement).

Ensuite, nous avons étudié les profils de dégradation de l'ARN 5'P dans des conditions de stress chez B. subtillis, L. plantarum et L. reuteri (Fig. 2c et Extended Data Fig. 4). Nous avons identifié des pauses ribosomiques claires chez L. plantarum au niveau des codons Tyr dans des conditions de choc thermique et de faible teneur en nutriments (LNUT), et au niveau des codons His et Arg en croissance stationnaire (STAT; Fig. 2c). 5P-seq donne un aperçu de l'accumulation dépendante des ribosomes d'intermédiaires de dégradation du 5′P à toutes les positions d'acides aminés, et nous avons utilisé ces données pour générer un «phénotype de protection des ribosomes» général spécifique aux acides aminés pour chaque échantillon (Méthodes). La combinaison de ce phénotype avec l'analyse en composantes principales (ACP) nous a permis de séparer les échantillons témoins, stressés et traités avec des médicaments chez L. plantarum (Fig. 2d). De même, la même stratégie sépare le traitement médicamenteux, les conditions de stress et la mesure temporelle de la phase stationnaire chez B. subtilis (24 h, 48 h et 8 j) (Fig. 2e). Ainsi, les phénotypes de protection des ribosomes spécifiques aux codons peuvent être exploités pour distinguer le traitement médicamenteux et d'autres conditions de stress. Pour analyser les blocages de ribosomes spécifiques aux codons en réponse aux changements environnementaux, nous nous sommes concentrés sur les lectures de 5′P associées aux blocages du site A du ribosome (données étendues Fig. 4c, d). Après un choc thermique chez L. plantarum, nous avons constaté que les codons Gln avaient une couverture en 5′P plus élevée, ce qui suggère des blocages de ribosomes spécifiques aux codons. En croissance stationnaire, les codons Arg (CGG, CGA, AGG et AGA, mais moins que CGG et CGU) étaient associés à des blocages de ribosomes (Extended Data Fig. 4e). Fait intéressant, lors de l'application de la même stratégie à B. subtilis. (Données étendues Fig. 4d), nous avons observé que le choc thermique était également associé à des blocages de ribosomes au niveau des codons Gln (CAA et CAG) et à une croissance stationnaire avec des blocages au niveau des codons Arg (CGC) (Données étendues Fig. 4f). Cela suggère que les défis environnementaux peuvent entraîner des blocages de ribosomes spécifiques aux codons similaires, qui peuvent résulter soit de défauts spécifiques au stress du traitement et de la biosynthèse de l'ARNt32,33, soit de changements dans les pools d'acides aminés29,34,35.

En plus des modèles globaux, 5PSeq fournit également des informations sur les blocages de ribosomes spécifiques aux gènes. Nous avons mesuré la force relative des modèles de protection de 3 nt à travers les gènes (indice de protection du cadre spécifique au gène (FPI) ; méthodes). Cela fournit une mesure du blocage relatif du dernier ribosome de traduction indépendant de l'abondance de l'ARNm pour chaque gène (c'est-à-dire en comparant les pics et les vallées le long de la séquence d'ARNm). Les traitements médicamenteux et anti-stress induisent des modifications du FPI de gènes individuels impliqués dans les réponses bactériennes (données étendues Fig. 5 et tableau supplémentaire 3). Par exemple, le choc thermique entraîne une augmentation du FPI (périodicité supérieure de 3 nt) pour les ARNm associés à la paroi des spores (taux de fausse découverte (FDR) <0,022), ainsi qu'un stress salin, avec une activité oxydoréductase (FDR <0,011). Au cours de la croissance stationnaire, le FPI des gènes liés à la paroi des spores a augmenté (FDR < 2, 2 × 10–16) tandis que celui des gènes impliqués dans la biosynthèse de Lys et le traitement de l'ARN ribosomal a diminué (FDR < 0, 024 et < 0, 044, respectivement). Fait intéressant, lorsqu'il est exposé à la CAM ou au MUP, le FPI relatif des gènes des protéines ribosomiques a clairement diminué (FDR < 2, 2 × 10–16), suggérant un changement relatif de la protection des ribosomes par rapport au reste du transcriptome en réponse aux médicaments. Ces résultats démontrent que 5P-seq peut informer sur la position du ribosome et la régulation de la traduction pendant le stress également au niveau spécifique du gène, et détecter des réponses traductionnelles phénotypiques rapides au traitement médicamenteux.

La quantification de l'abondance relative des intermédiaires de dégradation de l'ARNm peut être effectuée à l'aide de 5PSeq. Nous avons étudié comment le dégradé a été modifié globalement chez plusieurs espèces en utilisant différentes perturbations. Tout d'abord, nous avons étudié l'abondance à l'échelle du génome des molécules d'ARN 5′P (Extended Data Fig. 6a). La distribution de l'ARN 5′P sur le chromosome de B. subtilis était relativement stable pour tous les mutants de RNase testés, mais nous avons observé une augmentation des ARN provenant de régions intragéniques après un choc thermique. Chez E. coli, nous avons observé des différences entre les souches, avec des molécules d'ARN 5′P préférentiellement associées à la région codante dans DH5α et aux régions 5′ non traduites (UTR) dans MG1655, en accord avec les différences observées dans l'ARN 5′P autour des régions codantes. (Données étendues Fig. 2). Nous avons également observé une augmentation de l'ARN 5′P des régions intergéniques chez E. coli. Ensuite, nous avons étudié la variation des intermédiaires de dégradation du 5′P au niveau d'un seul gène, une mesure qui intègre l'abondance de chaque ARN mature avec la probabilité de décomposition (données étendues Fig. 6 et tableau supplémentaire 3). Nous avons quantifié l'abondance spécifique des gènes de fragments d'ARNm 5′P chez B. subtilis et montré que le choc thermique augmentait les intermédiaires de dégradation des gènes de germination des spores (FDR < 7,68 × 10–4), le stress salin et la biosynthèse de His (FDR < 2,2 × 10 –16). La croissance stationnaire a entraîné une diminution des fragments d'ARNm 5′P associés à la traduction chez B. subtilis et L. plantarum (FDR < 2, 2 × 10–16). Chez E. coli, le choc thermique a entraîné une diminution des intermédiaires de dégradation associés à la traduction (FDR < 2,2 × 10–16) et une augmentation de ceux associés au catabolisme du glucose (FDR < 0,016). Ensuite, nous avons examiné comment des RNases spécifiques de B. subtilis affectent l'abondance de fragments de dégradome d'ARNm 5′P spécifiques au gène. Conformément à notre analyse de métagène, la délétion rnjA s'est séparée de la souche de type sauvage et des mutants de délétion rnjB et rnY dans un PCA d'abondance spécifique au gène d'intermédiaires de dégradation de l'ARNm (données étendues Fig. 6b et tableau supplémentaire 4). Nous avons également observé une diminution des intermédiaires de dégradation associés à la traduction (FDR < 2,2 × 10–16) (tableau supplémentaire 3). La suppression de rnjB a entraîné une diminution des intermédiaires de dégradation associés au système sucre phosphotransférase dépendant du phosphoénolpyruvate (FDR < 2,2 × 10–16) et la suppression de rny a entraîné une diminution des intermédiaires de dégradation associés à la chimiotaxie (FDR < 2,2 × 10–16).

Pour caractériser les fonctions régulatrices des RNases, nous avons étudié l'effet de leur déplétion sur l'abondance des ARN régulateurs et des 5' UTR (données étendues Fig. 6c, d et tableau supplémentaire 4). La suppression de rnjA a entraîné une augmentation de l'histidyl-ARNt synthétase 5′ UTR (FDR < 8,86 × 10–7), du riboswitch T-box spécifique de la Ser tRNA ligase (FDR < 3,18 × 10–7) et du petit ARN régulateur roxS ( FDR < 7,9 × 10–4) parmi beaucoup d'autres (voir Données étendues Fig. 6c,d et Tableau supplémentaire 4 pour plus de détails et d'autres RNases). Fait intéressant, en plus de la couverture dans la région codante, nous avons également identifié des pics 5'P chevauchant les sites de début de transcription chez B. subtilis et E. coli (Extended Data Fig. 6e, f).

Après avoir montré que 5PSeq cartographie la dynamique des ribosomes chez les bactéries, nous l'avons ensuite appliqué à des échantillons mixtes. Bien que les microbiomes humains jouent un rôle dans la santé et la maladie36,37, notre compréhension de la régulation post-transcriptionnelle du microbiome est limitée. Le profilage des ribosomes, basé sur le fractionnement des polyribosomes suivi de l'empreinte et du séquençage in vitro des ribosomes, a été utilisé pour cartographier la position des ribosomes19, mais son application au microbiome est techniquement difficile38 et limitée par la petite taille des fragments de protection des ribosomes après digestion in vitro de l'ARN (~ 23 –24 nt)17,39. Le séquençage du dégradome présente des avantages potentiels, notamment (1) des fragments protégés par le ribosome générés in vivo plus longs, qui peuvent permettre la résolution d'espèces étroitement apparentées dans un échantillon (données étendues Fig. 7a); (2) simplicité, sans la nécessité d'un fractionnement subcellulaire40 ; (3) étant applicable aux échantillons d'ARN stockés5,41 ; et (4) fournir des informations sur la position des ribosomes in vivo, les blocages de ribosomes spécifiques aux codons et les limitations des acides aminés chez les espèces contenant de la RNase J, qui est estimée représenter environ 60 % des espèces bactériennes9.

Pour démontrer l'applicabilité de 5PSeq aux communautés bactériennes, nous avons d'abord analysé les intermédiaires de dégradation de l'ARNm 5′P dans un mélange de deux espèces étroitement apparentées, L. reuteri et L. plantarum. Nous avons regroupé différentes quantités d'ARN de L. plantarum traité au MUP avec L. reuteri non traité (1: 1–1: 10 000; Fig. 3a). Les pauses ribosomiques Ile associées au MUP peuvent être détectées même au rapport de 1:10 000 (abondance de 0,01 %). La limite est déterminée par la profondeur de séquençage (c'est-à-dire que dans le mélange 1:10 000, seules 82 lectures ont été mappées sur les séquences codantes de L. plantarum). Après avoir confirmé notre capacité à détecter des perturbations spécifiques à l'espèce, nous avons ensuite étudié la dynamique des ribosomes dans des normes de communauté microbienne définies (Extended Data Fig. 7b). Nous avons ensuite étudié des échantillons de microbiomes cliniques et environnementaux, en étudiant le métadégradome des microbiomes vaginaux à l'aide d'échantillons d'ARN préalablement isolés42. En plus de l'indication basée sur l'ARN de l'abondance des espèces, nous avons obtenu des profils de dégradation pour la plupart des espèces identifiées (Fig. 3b). Ces données ont permis l'étude des phénotypes de protection des ribosomes in vivo à travers les espèces et les patients. Enfin, nous avons appliqué notre méthode à des microbiomes plus complexes (microbiome fécal humain et compost ; données étendues Fig. 7c, d).

a, Courbes linéaires montrant l'abondance du métagène 5P|Seq par rapport aux codons Ile pour L. reuteri (bleu clair) et L. plantarum (violet) mélangés à différents rapports (1: 1–1: 10 000; L. plantarum contre L. reuteri ). Le traitement MUP de L. plantarum (en bas) a entraîné des pauses Ile claires par rapport au contrôle NT de L. reuteri. L. plantarum et L. reuteri ont 63 à 80% de similarité génomique entre leurs régions codantes. b, analyse 5PSeq de microbiomes vaginaux préalablement isolés. Les nombres de lectures attribuées à chaque espèce et aux donneurs sains sont indiqués par des cercles. Protection de trame relative et FFT, ainsi que la présence/l'absence de RNases sélectionnées, comme sur la Fig. 1.

Nous avons estimé que 5P-seq pourrait être capable de détecter des réponses post-transcriptionnelles spécifiques à l'espèce aux traitements médicamenteux indépendamment des changements dans l'abondance de l'ARNm. Nous avons analysé le métadégradome de cultures de microbiomes fécaux complexes riches en Bacillota et Bacteroidota en réponse à des médicaments ciblant la traduction (Fig. 4 et Extended Data Fig. 8a). Nous avons utilisé CAM, MUP, doxycycline (DOX, inhibition de l'allongement de la traduction) et érythromycine (ERY, interférence avec la translocation des aminoacyles). Nous nous sommes d'abord concentrés sur Bacillota (contenant de la RNase J) où le séquençage métadégradome offre une résolution plus élevée. Comme attendu de nos analyses précédentes sur des espèces isolées, l'utilisation de CAM et de MUP a conduit à des stalles spécifiques au contexte à Ile et Ala chez Bacillota, comme chez Enterococcus faecalis (classe Bacilli), Clostridium tyrobutiricum (classe Clostridia) et Anaeroglobus geminatus (classe Négativicutes) (Fig. 4a,b). Pour DOX, nous avons observé une nette accumulation d'ARN 5′P -11 nt à partir du codon d'initiation, indiquant une protection des ribosomes interrompue au niveau de l'initiation (Fig. 4c). Pour ERY, nous avons observé un blocage des ribosomes associé à des acides aminés chargés positivement, notamment Lys (K) et Arg (R). Cela s'est produit spécifiquement pour les motifs (R/K) × (R/K) (Fig. 4d) et Pro (Extended Data Fig. 8b), en accord avec les rapports précédents43,44,45,46. Les effets ont été observés dès 5 min après le traitement, avec des effets maximaux après 30 min (Fig. 4). Cette réponse retardée est compatible avec un taux de croissance plus lent des cultures fécales et un retard dans la réponse traductionnelle. Fait intéressant, chaque médicament a eu des effets variables sur les espèces bactériennes dans les cultures mixtes, ce qui suggère que l'état physiologique spécifique de la bactérie et la composition de la culture peuvent moduler la capacité des cellules à répondre à la perturbation de la traduction : par exemple, Enterococcus faecium46 n'a pas répondu aux médicaments dans nos expériences. (Données étendues Fig. 8c).

a – d, tracés linéaires montrant l'abondance du métagène 5PSeq par rapport aux caractéristiques sélectionnées. La distance par rapport à des acides aminés spécifiques est indiquée par le nombre de nucléotides. Exemple d'espèces de trois classes différentes—E. faecalis (Bacilli), C. tyrothricin (Clostridia) et A. geminatus (Negativicutes) - du phylum Bacillota sont présentés. a, Distribution des points terminaux 5' par rapport aux codons Ile dans les échantillons traités avec MUP après 5 et 30 min par rapport au contrôle NT. b, Comme dans a mais pour les codons Ala après traitement CAM. c, Comme dans a mais pour les codons d'initiation après traitement DOX. d, Comme dans a mais pour le premier codon des motifs tripeptidiques enrichis en Lys (K) et Arg (R) de la forme (R/K) × (R/K) dans les échantillons traités avec ERY.

Dans nos expériences sur le microbiome, nous avons également identifié la diversité des mécanismes de blocage des ribosomes de Bacillota. Les espèces des classes Clostridia et Negativicutes - par exemple, C. tyrobutiricum et l'agent pathogène opportuniste A. geminatus - ont une signature de protection supplémentaire 2 nt en amont d'un décrochage ribosomique (Fig. 4). Cela s'est produit avec tous les médicaments testés et les ribosomes affectés ont été bloqués à l'élongation ou à l'initiation. De plus, il a été conservé dans toutes les espèces phylogénétiquement apparentées, ce qui suggère que les ribosomes bloqués chez ces espèces interagissent avec des cofacteurs supplémentaires, ou présentent une conformation alternative, qui modifie les schémas de protection des ribosomes in vivo.

Enfin, nous avons testé l'effet des traitements antibiotiques sur le profil métadégradome des espèces Bacteroidota et Pseudomonadota dépourvues d'activité exonucléase 5′–3′. Bien que nous ne nous attendions pas à des informations sur un seul nucléotide sur le blocage différentiel des ribosomes, les traitements antibiotiques ont conduit à une accumulation de sites 5′P autour du codon d'initiation, comme observé pour CAM et ERY chez Bacteroides uniformis et Bacteroides fragilis, pour DOX chez Bacteroides thetaiotaomicron et pour MUP et CAM dans E. coli (Données étendues Fig. 8d). En résumé, nous avons montré que le séquençage du métadégradome peut révéler des informations spécifiques à l'espèce sur la régulation post-transcriptionnelle dans des échantillons de microbiome complexes.

Pour montrer l'étendue des utilisations de notre méthode, nous avons compilé un atlas de la désintégration de l'ARNm à travers l'arbre de vie bactérien (Fig. 5). Nous avons analysé 96 espèces dans 58 genres (Fig. 5 et tableaux supplémentaires 5 à 7), identifiant l'accord entre les modèles de dégradation de l'ARNm et la classification taxonomique et l'existence d'une périodicité de 3 nt dans la plupart des genres (Fig. 5, barplot intérieur en rouge). Les genres contenant de la RNase J, tels que ceux de Bacillota (en vert), ont une périodicité claire de 3 nt avec une préférence générale pour le 5'P dans le cadre F1 (par exemple, spp. Lactobacillus, Bacillus et Megasphaera). En revanche, les Bacteroidota plus dépendants du clivage endonucléolytique, avec les protéines des familles RNase E et G et la RNase Y, présentent des sites 5'P fréquemment associés au dernier nucléotide du codon (F2 ; Fig. 5, de couleur beige) dans , par exemple, Parabacteroides, Alistipes et Bacteroides. De nombreuses espèces ont des modèles 5′P associés aux codons plus complexes. Par exemple, Ureaplasma (Mycoplasmatota) et Akkermansia (Verrucomicrobia) ont des sites 5′P en F1 et F2 tandis que Caulobacter (Pseudomonadota) et Prevotella (Bacteroidota) sont associés à F1 et F0. Il est important de noter que la préférence pour le 5′P et la protection des ribosomes peuvent être influencées par les conditions environnementales ou les traitements médicamenteux19 ainsi que par la taxonomie. Quelques espèces pour lesquelles nous avons produit une couverture de séquençage en profondeur (Fig. 5, cercle gris intérieur), comme E. coli (représentant de la classe Gammaproteobacteria), ne montrent pas de nette préférence pour 5'P en ce qui concerne les positions des codons. Conformément à notre analyse précédente de la préférence de séquence pour les sites 5'P (Fig. 1c), nous observons que les espèces avec RNase J montrent peu de préférence spécifique à la séquence 5'P. Les espèces plus dépendantes de l'activité endonucléolytique de la RNase G utilisent souvent -1 U/+1 A tandis que celles qui dépendent de la RNase Y présentent un net enrichissement pour +1 A. protection des ribosomes bloqués au niveau des codons Ile après traitement au MUP (cercle violet extérieur, Fig. 5). En nous concentrant sur les Bacillota, en plus de la taille de protection attendue (c'est-à-dire 14 nt, comme sur la Fig. 2), nous avons observé des protections à -16 nt dans le genre Clostridia indiquant des mécanismes divergents en réponse aux ribosomes bloqués parmi les espèces phylogénétiquement apparentées. Ces résultats montrent que l'étude globale de la dégradation de l'ARNm in vivo, combinée à la perturbation de la traduction, est un outil utile dans la découverte de mécanismes actuellement non caractérisés pour la régulation de la traduction et la réponse spécifique à l'espèce aux traitements antibiotiques.

Arbre taxonomique des espèces étudiées. Cercles, de l'intérieur vers l'extérieur, gris (nombre de lectures attribuées) ; rouge (force de périodicité de 3 nt), préférence de cadre (F0, beige ; F1, vert ; F2, bleu clair) ; identification d'enzymes sélectionnées impliquées dans la dégradation de l'ARN au niveau du genre RNJA, RNY et RNE/G ; les ribonucléases de la famille des protéines E/G ; accumulation de paramètres 5′P 13–17 nt avant les codons Ile après 30 min de traitement MUP ; motifs de clivage 4 nt autour des points terminaux 5′P des espèces sélectionnées (en sautant Bacillota sans préférence de clivage (Fig. 1c)). Au total, 58 genres étaient présents dans des échantillons de bactéries cultivées et d'environnements complexes, y compris des écouvillons vaginaux, des fèces, des cultures fécales et du compost. Dans les échantillons complexes, les espèces avec au moins 1 000 lectures dans les régions codantes (300 dans le cas du compost) ont été prises en compte et les genres respectifs analysés (Méthodes).

Pour faciliter l'utilisation de notre ressource étudiant l'interaction entre les RNases et le processus de traduction à travers les bactéries, nous fournissons un site Web navigable interactif pour une exploration plus approfondie (http://metadegradome.pelechanolab.com).

Nous avons étudié les intermédiaires de dégradation de l'ARNm dans des espèces isolées et des microbiomes complexes à l'aide d'une méthode 5PSeq optimisée et avons constaté que la dégradation co-traductionnelle de l'ARNm est répandue parmi les bactéries. Chez les espèces contenant de la RNase J, les intermédiaires de désintégration de l'ARNm 5′P ont fourni des informations sur la protection des ribosomes à une résolution mononucléotidique. Notre approche permet l'étude in vivo des blocages de ribosomes spécifiques aux codons et aux gènes sans nécessiter de traitement médicamenteux, de fractionnement subcellulaire ou de dégradation de l'ARN in vitro. Nous montrons que le 5PSeq optimisé peut détecter une régulation traductionnelle déclenchée par l'environnement chez plusieurs espèces, à la fois au niveau des codons (Fig. 2) et des gènes (tableau supplémentaire 3). Chez les espèces sans activité exonucléase 5'–3', la perturbation du processus de traduction a entraîné des altérations de la distribution du 5′P le long des gènes. Cela suggère que, malgré l'absence d'une exonucléase 5'–3' capable d'imprimer la position du ribosome à une résolution d'un seul nucléotide, les changements de position du ribosome façonnent également le dégradome co-traductionnel de l'ARNm chez ces espèces. Nous avons exploité les processus de désintégration co-traductionnelle chez les bactéries pour montrer que 5PSeq peut détecter des réponses post-transcriptionnelles rapides (dans les 5 min) aux perturbations du processus de traduction par un traitement médicamenteux, indépendamment des changements dans l'abondance de l'ARNm. Étant donné que la désintégration de l'ARNm co-traductionnelle est répandue mais distinctive parmi les espèces bactériennes, une signature 5PSeq peut être appliquée pour capturer les réponses post-transcriptionnelles spécifiques à l'espèce aux perturbations. Nous proposons que l'adoption de notre méthode permet potentiellement l'étude de la régulation environnementale ou chimique de la traduction sans avoir besoin de culture ou de fractionnement subcellulaire. En utilisant notre méthode optimisée, nous montrons que la position du ribosome est essentielle pour façonner les limites et l'abondance des dégradations bactériennes. Nous montrons que les changements environnementaux conduisant à des défauts spécifiques au stress dans la biosynthèse ou le traitement de l'ARNt32, ou à des changements dans la disponibilité des acides aminés47, modifient le dégradome de manière prévisible chez les espèces contenant de la RNase J. De plus, nos travaux suggèrent qu'une réponse bactérienne stricte, en plus de contrôler la transcription et la traduction35,48, modifie également le dégradome bactérien. Nous montrons également que les blocages de ribosomes et les modèles de désintégration co-traductionnels associés sont hautement régulés dans les conditions de stress et peuvent être utilisés pour étudier les altérations spécifiques aux gènes indépendamment des changements dans l'abondance de l'ARNm. Par exemple, nous avons observé des changements clairs dans la périodicité de 3 nt (FPI) spécifique au gène pour les gènes associés à la traduction et à la formation de la paroi des spores chez B. subtilis (Extended Data Fig. 5). En disséquant la contribution de différentes RNases au dégradome chez B. subtilis, nous avons également identifié la régulation spécifique des gènes des 5' UTR régulateurs et des petits ARN régulateurs (tableau supplémentaire 4) ainsi que leur interaction avec les ribocommutateurs bactériens49. Ces informations seront utiles pour la dissection future des éléments régulateurs dans les leaders de l'ARNm et pour faciliter la dissection moléculaire de leur mécanisme d'action. Il est important de noter que l'analyse du métadégradome effectuée dans ce manuscrit est directement applicable à une grande variété d'espèces cultivables et incultivables où l'abondance de RNase peut être facilement déduite (tableau supplémentaire 6), ouvrant ainsi la voie à la dissection moléculaire de la décomposition de l'ARN chez des bactéries non modèles. espèces.

Enfin, nous montrons que 5PSeq peut être largement appliqué à des microbiomes cliniques et environnementaux complexes pour obtenir des profils de métadégradomes spécifiques à l'espèce. En éliminant le besoin de protocoles expérimentaux complexes et de culture bactérienne, les chercheurs seront en mesure d'analyser les phénotypes de protection des ribosomes chez les espèces bactériennes incultivables, dont on estime qu'elles représentent plus de la moitié des communautés bactériennes humaines50. Notre approche peut détecter des réponses translationnelles même chez des espèces présentes à 0,01 % d'abondance dans une communauté bactérienne et, en utilisant les empreintes de ribosomes plus longues, elle permet l'analyse de communautés bactériennes complexes à une résolution d'espèce unique. Pour démontrer son utilité et sa capacité à compléter les approches métagénomiques actuelles, nous caractérisons la dynamique des ribosomes dans des cultures fécales complexes après un traitement antibiotique. Nos travaux montrent que 5PSeq peut facilement identifier des réponses post-transcriptionnelles rapides aux antibiotiques ciblant le processus de traduction. Cela confirme notre capacité à étudier les changements spécifiques aux codons dans des échantillons microbiens complexes et ouvre la voie à l'utilisation de signatures de dégradome comme rapporteurs moléculaires pour les réponses spécifiques aux espèces aux médicaments. Nous fournissons un atlas de la dégradation bactérienne de l'ARNm pour 96 espèces couvrant 58 genres. Nos résultats mettent en évidence la diversité des mécanismes de dégradation de l'ARNm chez les procaryotes et démontrent l'utilité de combiner la perturbation de la traduction et le dégradome de l'ARNm 5'P. Nous prévoyons qu'en combinant le séquençage de l'ARN 5′P (tableau supplémentaire 4) avec une mesure des RNases exprimées (tableau supplémentaire 7), l'étude du métadégradome facilitera à l'avenir la caractérisation mécaniste des leaders 5' régulateurs en moins- espèces bien caractérisées.

En résumé, notre analyse de la dégradation de l'ARNm à travers l'arbre de vie bactérien révèle comment le métadégradome fournit des informations précieuses sur la physiologie spécifique à l'espèce, y compris les réponses aux médicaments, la disponibilité intracellulaire des acides aminés et les réponses environnementales. Les analyses du métadégradome permettront de caractériser la régulation post-transcriptionnelle dans les microbiomes et de faire la lumière sur la biologie des communautés microbiennes.

Des cultures bactériennes d'une nuit (ne dépassant pas la densité optique 1 (OD600 = 1) ont été utilisées pour diluer la culture principale à une DO600 de départ de 0,03 à 0,05. Les cultures ont été récoltées par centrifugation en atteignant la phase logarithmique (OD600 = 0,4 à 0,8) sauf indication contraire. Sauf indication contraire, les cultures bactériennes ont été cultivées à 37 ° C avec rotation en utilisant les milieux de croissance recommandés. Plus précisément, L. plantarum (ATCC 8014) et L. reuteri (DSM 17938) ont été cultivés dans du bouillon MRS (Sigma-Aldrich). L Les traitements de stress plantarum ont été effectués comme suit : des cultures en phase stationnaire ont été cultivées pendant 27 h après l'inoculation et récoltées à OD600 = ~ 4,5. Pour générer des échantillons pour le contrôle non traité, le choc thermique et les cultures répliquées biologiques à faible teneur en nutriments (40 ml) ont été cultivés jusqu'à la phase mi-logarithmique (OD600 = 0,3 à 0,6), divisés (10 ml pour le contrôle non traité, 15 ml pour le choc thermique et 15 ml pour l'échantillon à faible teneur en nutriments) et les cellules récoltées par centrifugation. immédiatement pour l'analyse de l'ARN. Avant le choc thermique, les cellules ont été remises en suspension dans du bouillon MRS préchauffé et incubées dans un thermomixeur pendant 15 min à 60 °C. Les culots cellulaires à faible teneur en nutriments ont été soigneusement lavés avec 50 ml de milieu LB 0, 5 × (Sigma), centrifugés et le surnageant complètement éliminé. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans du milieu LB 0,5 × préchauffé (Sigma) et récoltées après un temps d'incubation total de 15 min à 37 ° CB subtilis (168trpC2) a été cultivé dans 2 × YT (1,6 % (wt/vol) tryptone (Bacto), 1 % (wt/vol) d'extrait de levure (Bacto) et 0,5 % (wt/vol) de NaCl. Pour une croissance prolongée, nous avons prélevé des échantillons à mi-journal, 24 h, 48 h et 8 jours après l'inoculation. Le stress salin a été réalisé en mélangeant volumes égaux de NaCl 2 M avec B. subtilis cultivé en phase logarithmique moyenne (OD600 = 0,5–0,6), suivi d'une incubation de 10 min à température ambiante et d'une récolte par centrifugation Cultures biologiques répliquées de L. plantarum, L. reuteri, E. coli (Invitrogen, n° 18265-017) et B. amyloliquefaciens ont été cultivés dans du milieu LB jusqu'à la phase logarithmique, puis les cultures ont été divisées pour générer des échantillons pour le contrôle non traité et le contrôle fragmenté aléatoire. cultures de L. plantarum et L. reuteri cultivées à une concentration finale de 100 µg ml–1, incubées pendant 5 min à 37 °C puis récoltées sur de la glace contenant 100 µg ml–1 supplémentaires de CAM5. Le traitement au MUP (concentration finale 65 µg ml–1) de L. plantarum et L. reuteri à mi-log a été effectué pendant 10 min à 37 °C après centrifugation et congélation éclair du culot. C. crescentus (souche NA1000) a été cultivée dans un milieu PYE contenant 0,2 % (wt/vol) de peptone (Bacto) et 0,1 % d'extrait de levure (Bacto) à 30 °C jusqu'à mi-log, suivi d'une centrifugation et d'une congélation rapide du culot cellulaire. La souche PCC6083 de Synechocystis a été cultivée dans un milieu de croissance BG11 à 30 °C à une intensité lumineuse de 30 µE et 1 % de CO2 atmosphérique et récoltée à mi-log phase51. Les traitements par choc thermique pour les souches E. coli, B. subtilis de type sauvage et knock-out RNase ont été effectués comme suit : la souche E. coli (MG1655) a été cultivée dans un milieu LB à 37 °C jusqu'à la phase logarithmique tardive (0,6–0,8) ; Les souches de B. subtilis de type sauvage (168trpC2), rnjA, rnjB et rny ont été cultivées à 37 °C dans du LB (supplémenté avec 100 µg ml–1 de spectinomycine pour rnjA et 5 µg ml–1 de kanamycine pour la délétion rnjB et rny souches) à log phase de croissance (0,2–0,3). La culture a été scindée en deux, le culot cellulaire recueilli par centrifugation et l'échantillon témoin non traité immédiatement congelé instantanément. Le choc thermique a été effectué en remettant les cellules en suspension dans du milieu LB préchauffé à 65 ° C, suivi d'une incubation de 10 minutes à 65 ° C. Les échantillons ont été récoltés par centrifugation et congelés par choc dans un bain d'éthanol/glace sèche pour l'analyse de l'ARN.

Pour le traitement antibiotique d'E. coli, la souche MG1655 a été cultivée dans du LB à 37 °C jusqu'à la phase exponentielle et les cultures ont été divisées en trois pour l'échantillonnage du témoin non traité, MUP (65 µg ml–1) et CAM (100 µg ml–1). Les cultures ont été incubées avec des antibiotiques pendant 10 min à 37 ° C, récoltées par centrifugation et congelées par choc dans un bain d'éthanol / neige carbonique pour l'analyse de l'ARN.

Pour l'expression de la RNase J dans E. coli, les dix premières cellules ont été transformées avec le plasmide contenant la séquence codante de la RNase JA de S. pyogenes (plasmide pEC622 : pEC85 avec le promoteur rnjA + rnjA (exprimant la RNase J1 pour la complémentation dans S. pyogenes (pEC85 répliques dans E. coli), un don de E. Charpentier) Les souches A. finegoldii (DSM 17242), P. copri (DSM 18205), P. merdae (DSM 19495) et P. timonesis (DSM 22865) ont été cultivées en anaérobiose dans un bouillon GAM (HyServe) pendant 24 h. Le cas échéant, les espèces ont été traitées avec du MUP (65 µg ml-1) ou de la CAM (100 µg ml-1) pendant 10 min. Après incubation, des aliquotes de 1 ml ont été prélevées et les cellules ont été traitées par catalyse. inactivé par l'ajout de RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) et récolté par centrifugation.

Pour surveiller les effets des médicaments sur la dynamique du métadégradome, nous avons examiné deux microbiomes intestinaux humains cultivés en anaérobie contre quatre médicaments au fil du temps. Les microbiomes intestinaux de patients en bonne santé ont été collectés et remis en suspension dans du glycérol à 40 % et des aliquotes de 500 µl ont été stockés à -80 °C. Une aliquote a été utilisée pour inoculer 10 ml de culture starter maintenue dans un bouillon MCDA pendant 24 h 53 en l'absence d'oxygène et en présence de 2,5 à 3,0 % d'hydrogène à 37 °C. Pour s'assurer que la communauté microbienne était dans une phase de croissance métaboliquement active, nous avons dilué les cultures de démarrage avec du milieu MCDA frais à un rapport de 1:10 24 h avant de commencer l'expérience, dans un volume total de 30 ml, dans les conditions anaérobies indiquées ci-dessus. mais sans trembler. Pour le traitement antibiotique, 6 ml de culture fécale ont été transférés dans un tube Falcon de 15 ml, soit sans antibiotiques, soit additionnés de CAM (80 µg ml–1), MUP (650 µg ml–1), DOX (5 µg ml–1) ou ERY (5 µg ml–1). Après incubation pendant 5 min, 30 min ou 48 h, des aliquotes de 1 ml ont été prélevées et les cellules en croissance inactivées catalytiquement par l'ajout de RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) (t0 avant le traitement et à 5 min, 30 min et 48 h après le traitement) et récolté par centrifugation. Le nombre de répétitions pour chaque échantillon est indiqué dans le tableau supplémentaire 2.

L'extraction de l'ARN (sauf indication contraire) a été réalisée comme décrit dans la réf. 54, avec des modifications mineures. En bref, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans des volumes égaux de LET (Tris 25 mM pH 8, 0, LiCl 100 mM, EDTA 20 mM) et de phénol saturé en eau pH 6, 6 (Thermo Fisher). Les cellules ont été lysées avec des billes de verre lavées à l'acide (Sigma-Aldrich) par vortex pendant 3 min dans MultiMixer. Suite à l'ajout de volumes égaux de phénol/chloroforme/alcool isoamylique pH 4,5 (25:24:1) et d'eau sans nucléase, la lyse a été prolongée par 2 minutes supplémentaires de vortex suivies d'une centrifugation. La phase aqueuse résultante a été purifiée en deux étapes en utilisant du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) puis du chloroforme. Après centrifugation, la phase aqueuse propre a été précipitée avec de l'acétate de sodium-éthanol. Pour les mélanges de Lactobacillus (Fig. 3a), l'ARN microbien extrait de L. plantarum (témoin non traité et traité au MUP) a été mélangé avant l'étape de ligature d'ARN du protocole de bibliothèque 5P-seq à différents rapports avec l'ARN extrait de L. reuteri (non traité) . Des répliques techniques du Microbial Community Standard (Zymobiomics, n° D6300, lot n° ZRC 190633), composées de huit souches bactériennes désactivées, ont été générées par extraction d'ARN à partir de 75 à 125 µl de suspension cellulaire décongelée. Les échantillons d'écouvillons vaginaux ont été lysés mécaniquement à l'aide de billes dans 1 000 µl de bouclier ADN/ARN (ZymoResearch) et le lysat a été stocké à -80 °C pendant 2 mois avant utilisation. Le lysat a été décongelé et 250 ul utilisés pour extraire l'ARN microbien. Les fèces d'un donneur sain ont été recueillies et transportées dans du glycérol à 40 %. Des répliques techniques d'ARN ont été extraites le jour indiqué ci-dessus, avec des modifications mineures répertoriées comme suit. En bref, 500 µl de suspension de fèces/glycérol ont été mélangés avec un volume égal de tampon LET contenant du SDS (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS) et du phénol saturé d'eau pH 6,6 (Thermo Fisher ). La lyse a été réalisée par vortex avec des billes de carbure ; la durée a été prolongée à 10 min après l'ajout de volumes égaux de phénol/chloroforme/alcool isoamylique pH 4,5 (25:24:1) et d'eau sans nucléase. Toutes les étapes suivantes ont été effectuées comme décrit ci-dessus. L'ARN de l'expérience temporelle du microbiome intestinal cultivé a été extrait comme indiqué, avec des modifications du tampon LET contenant du SDS (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS). L'ARN du compost a été extrait avec 2 g de matière première (de Sundbyberg, Suède) à l'aide du kit RNeasy PowerSoil Total RNA (Qiagen) comme recommandé dans les directives du fabricant. La qualité de l'ARN a été évaluée en chargeant soit 1 µg d'ARN total sur un gel d'agarose à 1,2 %, soit 12 ng d'ARN total sur un BioAnalyzer à l'aide d'une puce RNA Nano 6000 (Agilent Technologies). Avant la préparation de la bibliothèque 5P-seq, l'ARN a été quantifié à l'aide du kit Qubit RNA BR (Broad-Range) (Thermo Fisher Scientific) conformément aux directives du fabricant.

La purification de l'ADN a été réalisée en lysant les cellules de la communauté microbienne intestinale avec des billes de verre (Sigma), combinées à une extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique et à une précipitation à l'éthanol. Le protocole de flux de travail était identique à la procédure d'extraction d'ARN décrite ci-dessus mais avec la substitution de LET (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS) par 10 mM Tris-HCl pH 8,0 et la substitution de phénol /chloroforme/alcool isoamylique pH 4,5 avec UltraPure phénol/chloroforme/alcool isoamylique pH 8,0 (Invitrogen)

Le fractionnement du polyribosme a été effectué comme décrit précédemment55, avec des modifications mineures. En bref, B. subtilis (168trpC2) a été cultivé dans du milieu LB jusqu'à la phase médiane à 37 ° C et récolté sur de la glace contenant 100 µg ml – 1 CAM, avec une centrifugation de 5 min. Le culot résultant a été lysé dans 1 × TN (50 mM Tris/HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 μg ml-1 CAM et un comprimé complet d'inhibiteur de protéase sans EDTA) à l'aide de billes de verre avec vortex pendant 2 min , suivi de 5 min d'incubation sur glace. La lyse et l'incubation ont été répétées deux fois. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation à 1 500 g pendant 5 min à 4 ° C et le surnageant chargé sur un gradient de saccharose de 15 à 50 % avec un coussin à 80 %. Après ultracentrifugation à 36 000 tr/min pendant 90 min, Abs254 a été contrôlé et fractionné. Ensuite, l'ARN a été extrait des fractions de saccharose par addition de volumes égaux de phénol/chloroforme/alcool isoamylique pH 4,5 (25:24:1) et d'eau sans nucléase, suivi de 2 min de vortex et de centrifugation. La phase aqueuse a été ensuite nettoyée par addition de chloroforme, vortex et centrifugation et la phase aqueuse résultante acétate de sodium/éthanol a été précipitée.

Nos bibliothèques 5P-seq ont été préparées comme décrit précédemment5,41, avec des modifications mineures, en utilisant 150 à 9 000 ng d'ARN total comme entrée. Pour préparer des échantillons fragmentés aléatoires (témoins négatifs), l'ARN ribosomique a été appauvri à partir d'ARN sans ADN et la fragmentation ultérieure par incubation pendant 5 min à 80 ° C dans un tampon de fragmentation (40 mM Tris acétate pH 8,1, 100 mM KOAc, 30 mM MgOAc) . La réaction a été purifiée en utilisant deux volumes de billes RNACleanXP (Beckman Coulter) comme recommandé par le fabricant. Les sites 5' OH libres ont été rephosphorylés à l'aide de 5 U de polynucléotide kinase T4 (NEB) et incubés à 37 ° C pendant 60 min, comme recommandé par le fabricant. L'ARN fragmenté rephosphorylé a été purifié en utilisant du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (24:25:1) suivi d'une précipitation à l'acétate de sodium/éthanol. À partir de ce pas en avant, les procédures de préparation de bibliothèques aléatoires fragmentées et standard de 5P-seq ont été fusionnées41. L'ARN a été ligaturé à l'oligo rP5_RND ou rP5_RNA (tableau supplémentaire 1) contenant des identifiants moléculaires uniques. L'ARN ribosomique a été appauvri à l'aide du kit d'élimination de l'ARNr Ribozero (Illumina), qui convient aux bactéries, aux levures et aux échantillons humains. L'échantillon appauvri en ARNr a été purifié à l'aide de 1, 8 volumes de billes Ampure (Abcam) et fragmenté par la chaleur (80 ° C) pendant 5 min dans un tampon de fragmentation 5 × (200 mM Tris acétate pH 8, 1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOAc). Les échantillons suivants ont été soumis à une transcription inverse en utilisant des hexamères aléatoires pour l'amorçage. L'ADN complémentaire résultant a été lié à des billes de streptavidine (M-280), soumis à des réactions enzymatiques de réparation des extrémités d'ADN et de remplissage d'adénine aux extrémités 5' saillantes des fragments d'ADN en utilisant le fragment de Klenow (NEB). L'adaptateur commun (P7-MPX) a été ligaturé et les bibliothèques 5P-seq ont été amplifiées par PCR (15 à 17 cycles), purifiées à l'aide de 1,8 volumes de billes Ampure (Abcam) et quantifiées avec Qubit (Thermo Fisher). La taille de la bibliothèque a été estimée à partir des traces du bioanalyseur. Les bibliothèques 5P-seq ont été regroupées en mélangeant des quantités égales de chaque échantillon, puis en enrichissant des fragments de 300 à 500 nt.

Au cours des travaux décrits dans ce manuscrit, notre laboratoire a développé une stratégie 5P-seq simplifiée à haut débit qui a été appliquée à un sous-ensemble d'échantillons, comme détaillé dans le tableau supplémentaire 2. Les bibliothèques compilées par cette stratégie ont été générées comme décrit récemment15,56. En bref, l'ARN sans ADN a été ligaturé avec des oligos d'ARN contenant des identifiants moléculaires uniques. L'ARN ligaturé a été rétrotranscrit par amorçage avec des oligos contenant un hexamère aléatoire et une région compatible avec Illumina. L'ARN a été éliminé par addition de NaOH. L'ARN ribosomal a été appauvri par l'ajout de mélanges internes d'épuisement d'oligo-ADN d'ARNr (tableau supplémentaire 1) à l'ADNc et par la réalisation d'un traitement à la nucléase duplex spécifique (DSN, Evrogen). L'ADNc appauvri en ARNr a été amplifié par PCR (15 à 17 cycles). L'épuisement de l'ARNr avec Ribozero Illumina (pour les bactéries et les levures) a été effectué après l'étape de ligature de l'ARN simple brin. L'ARN appauvri en ribosomes a été purifié et transcrit en utilisant les oligos mentionnés ci-dessus, puis amplifié par PCR. Les bibliothèques ont été quantifiées par fluorescence (Qubit, Thermo Fisher), leur taille estimée à l'aide d'un Agilent Bioanalyser et séquencées à l'aide d'un séquenceur NextSeq500 ou NextSeq2000 Illumina.

Les bibliothèques d'ADN ont été préparées à partir de points temporels de cultures fécales non traitées (t0) et traitées à 48 h (t48h) conformément aux directives du fabricant (Kit ThruPlex DNA-Seq, Takara Bio). En bref, l'ADN a été cisaillé à l'aide d'un ultrasonateur focalisé ME220 (Covaris) jusqu'à une taille moyenne de 350 nt (microtube AFA Fiber Crimp-Cap, PN 520053). L'ADN cisaillé (30 ng) a été utilisé pour mettre en œuvre une réaction de réparation de l'extrémité de l'ADN, suivie d'une synthèse de bibliothèque et d'une amplification par PCR (dix cycles) avec les amorces NEBi5 et PE2. Les bibliothèques d'ADN ont été purifiées à l'aide d'Ampure XP, quantifiées par fluorescence (Qubit, Thermo Fisher) et séquencées à l'aide d'un séquenceur NextSeq2000 Illumina.

Le démultiplexage et la génération fastq des fichiers image bcl de séquençage ont été effectués à l'aide de bcl2fastq (v.2) avec les options par défaut. L'adaptation et le rognage de qualité ont été réalisés avec le programme bbduk de la suite BBTools (https://sourceforge.net/projects/bbmap/), avec les options (qtrim=r, ktrim=r, hdist=3, hdist2=2, K= 20, mink=14, trimq=16, minlen=30, maq=16), en utilisant le jeu d'adaptateurs par défaut BBTools et les séquences polyG ou polyA pour les lectures courtes. Pour réduire le temps de calcul, les lectures avec un identifiant moléculaire unique (UMI) et une séquence d'insertion identiques ont été dédupliquées avant la cartographie à l'aide du programme de déduplication de la suite BBTools avec des paramètres par défaut. Les séquences UMI trouvées dans les huit premières bases de chaque lecture ont été extraites à l'aide des outils UMI (v.1) avec les options par défaut (en utilisant --bc-pattern NNNNNNNN).

Les génomes bactériens ont été téléchargés le 21 mars 2019 à partir de la base de données National Center for Biotechnology Information Assembly (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) avec les termes de recherche suivants : "bacteria"[Filter] AND (latest [filtre] ET ("génome représentatif"[filtre] OU "génome de référence"[filtre]) ET (tous[filtre] NON "dérivés d'un projet de surveillance"[filtre] ET tous[filtre] NON anormaux[filtre])). La liste a ensuite été filtrée pour n'inclure qu'une seule souche par espèce, en donnant la priorité aux génomes marqués comme "référence". Les 5 804 génomes résultants (tableau supplémentaire 4) ont été utilisés pour construire l'indice de référence. L'index a été construit avec le programme bbmap de la suite BBTools, avec les options par défaut (et k = 10). Outre l'indice de référence contenant les 5 804 génomes bactériens, des indices distincts ont été construits pour les espèces cultivées individuellement et les groupes au niveau du genre. Les génomes de ces derniers groupes ont été choisis parmi l'ensemble initial de 5 804 génomes. L'alignement a été réalisé avec le programme bbmap de la suite BBTools, avec les paramètres (32 bit=t -da -eoom k = 11 strictmaxindel=10 intronlen=0 t = 16 trd=t minid=0.94 nzo=t). Les fichiers d'alignement ont été triés et indexés avec SAMtools57. La déduplication basée sur les UMI a ensuite été effectuée avec UMI-tools (v.1)58, avec les options (--soft-clip-threshold 1 --edit-distance 2 --method unique). Les fichiers BAM ont ensuite été traités pour énumérer le nombre de lectures par espèce. Nous avons utilisé un dictionnaire préenregistré des noms de chromosomes et d'espèces et un script personnalisé pour effectuer des comptages dans chaque espèce. La distribution des comptes entre les gènes codant pour l'ARNr, l'ARNt, l'ARNm et d'autres types d'ARN a été calculée avec des outils de lit (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/). Les comptages au niveau des gènes codant pour l'ARNm ont été utilisés pour sélectionner les principales espèces dans des échantillons complexes, comme décrit ci-dessous.

Les espèces cultivées individuellement ont été directement cartographiées à leurs indices de référence. Tous les mélanges Zymobiomics et les échantillons de microbiome vaginal, fécal et de compost ont été alignés sur l'indice de référence bactérien qui comprenait les 5 804 espèces. Nous avons choisi des espèces avec au moins 1 000 lectures dans les régions de codage dans tous les échantillons sauf pour le compost, où nous avons assoupli la sélection à 300 lectures car il y avait moins d'espèces avec des comptes élevés. Au total, 83 espèces bactériennes avec une couverture spécifiée appartenant à 46 genres ont été identifiées à partir de tous les échantillons. Des indices de référence ont été construits pour ces 46 genres (les espèces ont été choisies parmi la liste présélectionnée de 5 804), et tous les échantillons complexes de matières fécales et de compost ont été alignés séparément sur ces références.

Des fichiers d'alignement dédupliqués, ainsi que des fichiers de séquence et d'annotation du génome, ont été fournis en entrée de notre package fivepseq14 récemment développé pour l'analyse et la visualisation de la distribution des points finaux 5' des lectures avec les options par défaut appliquées. Fivepseq fournit des informations concernant la présence d'une périodicité de 3 nt (FFT), la distribution des comptages 5' par rapport au démarrage/arrêt du CDS ou aux nucléotides dans chaque codon (cadres de traduction) et les modèles de protection spécifiques aux codons et aux acides aminés. Étant donné que fivepseq n'analyse qu'un seul génome par exécution, les fichiers d'alignement pour les échantillons complexes ont été utilisés comme entrée pour fivepseq pour chaque génome séparément. Pour l'analyse au niveau du genre, les fichiers de séquence et d'annotation pour les espèces individuelles ont été concaténés en un seul. Enfin, nous avons compilé une ressource en ligne avec une navigation interactive des rapports produits à partir des bactéries non traitées avec une couverture élevée, à http://metadegradome.pelechanolab.com.

Pour générer un phénotype de protection des ribosomes, nous avons pris la somme des comptages positionnés de 30 à 1 nt en amont de chaque acide aminé et des comptages à l'échelle par acide aminé concaténés pour obtenir un vecteur décrivant la protection des ribosomes dans chaque échantillon. Ces vecteurs ont été utilisés comme entrée pour l'ACP effectuée avec la fonction prcomp du package R stats (v.3.6.1). Les tracés PCA ont été générés avec le package autoplotly (v.0.1.2) dans R.

Les annotations de Bacillus subtilis pour les sites de début de transcription (TSS) et les UTR ont été obtenues à partir de BSGatlas59. Les annotations E. coli pour les TSS et les UTR ont été obtenues à partir de RegulonDB60. Les lectures 5′P ont été attribuées à un TSS donné si elles chevauchaient ce TSS dans une fenêtre de ± 5 paires de bases. Pour la distribution des lectures (données étendues Fig. 6a) et les cartes thermiques (données étendues Fig. 6e, f), les répliques ont été regroupées et le nombre de lectures brutes ou normalisées en fonction de la taille de la bibliothèque a été moyenné sur les répliques. La couverture spécifique au brin des lectures 5′P a été calculée et représentée sous forme de cartes thermiques à l'aide de deepTools (v.3.3.2)61. Pour l'analyse différentielle des lectures 5′P dans différentes caractéristiques d'annotation génique, celles de chaque caractéristique d'annotation génique ont été énumérées à l'aide de featureCounts du package R Rsubread (v.2.6.4)62,63. Des analyses différentielles ont été effectuées à l'aide de edgeR (v.3.34.1)63.

Les motifs de clivage 5'P ont été calculés à partir de la composition de la séquence des transcrits, impliquant les nucléotides de la région 4 en amont et en aval des positions de cartographie 5' de toutes les lectures. Si plusieurs lectures étaient mappées à la même position, nous avons considéré la composition de base de cette région plusieurs fois. En utilisant les fréquences de base obtenues, nous avons ensuite procédé à la production de logos de séquence avec le package R ggseqlogo64, en utilisant l'entropie de Shannon (bits) pour calculer la contribution de chaque nucléotide à chaque position.

Les arbres taxonomiques ont été générés avec l'outil graphlan (v.0.9.7) (https://huttenhower.sph.harvard.edu/graphlan). Les informations de lignée taxonomique pour les 84 espèces bactériennes identifiées dans nos échantillons ont été téléchargées à partir de la base de données NCBI Taxonomy avec le programme efetch de NCBI e-utilities. Les arbres ont été annotés avec des informations sur la taille de la bibliothèque, la périodicité de 3 nt, le cadre de protection du ribosome préféré et la présence d'annotations enzymatiques pour chaque genre (Données supplémentaires 1). La taille de la bibliothèque était égale au nombre maximal de lectures d'ARNm par espèce et par échantillon, dans la plage de 0 à 1 (≥ 1 million) de lectures. La périodicité de 3 nt a été calculée en tenant compte de la valeur absolue du signal FFT pour l'onde de périodicité de 3 nt et de la préférence pour la trame de protection des ribosomes, telle que calculée par le package fivepseq. Pour la FFT, le nombre maximum de signaux pour les transcrits alignés au début ou à la fin a été pris. La préférence pour le cadre de protection des ribosomes a été évaluée sur la base de la valeur de FPI, calculée par le package fivepseq comme 2 × F/(∑1F1 - Fi), pour chaque cadre Fi. Le cadre avec la valeur FPI absolue maximale a été considéré comme (mal) préféré, et la signification de cette préférence a été évaluée sur la base des valeurs P du test t comparant les comptages dans le cadre donné avec les deux autres combinés (les valeurs FPI et P se trouvent dans le fichier frame_stats.txt de la sortie fivepseq). Une valeur FPI positive signifie que l'un des nucléotides de chaque codon a en moyenne un nombre plus élevé (est préféré) tandis qu'une valeur négative signifie qu'un des nucléotides en moyenne a un nombre faible (est mal préféré) et que les deux autres nucléotides reçoivent un nombre plus élevé : par exemple, si F1 est préféré, il aura une valeur FPI positive et sera mis en surbrillance dans l'arborescence comme une seule trame de protection préférée tandis que si, disons, F2 est (mal) préféré (a une valeur FPI négative), l'arbre sera mis en surbrillance F0 et F1 comme trames de préférence. Les valeurs FFT et FPI étaient comprises entre 0 et 1, et le maximum des deux valeurs a été pris pour décrire la force de la périodicité de 3 nt. Les annotations enzymatiques ont été obtenues à partir de la base de données EggNOG (v.5.0)65 La présence de chaque enzyme dans chaque genre a été comptée comme un nombre compris entre 0 et 1, en fonction de la fraction d'espèces au sein du genre annotée avec l'enzyme. L'arborescence met en évidence ces valeurs avec l'opacité correspondante.

L'analyse fonctionnelle a été effectuée sur des listes de gènes présentant soit une abondance différentielle, soit une protection différentielle du cadre entre les conditions de stress et de contrôle. Le FPI pour chaque transcription a été calculé comme décrit ci-dessus. Le changement de pli des FPI a été calculé comme la différence de FPI moyen entre la condition de stress/mutante et le contrôle non traité/de type sauvage pour chaque transcrit. L'abondance différentielle des nombres de points finaux 5' pour chaque transcrit a été calculée comme l'expression log2 (changement de pli) avec le package DESeq2 R66 en utilisant l'estimation adaptative de rétrécissement préalable du test t de Student (apeglm).

L'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes a été effectuée avec le package R WebGestaltR67 sur la base de l'expression différentielle de changement de pli ou des valeurs FPI. Les fichiers au format GMT pour chaque espèce ont été obtenus par modification des annotations de protéines Uniprot et utilisés comme bases de données d'enrichissement. Les fichiers d'annotation GFF pour chaque espèce ont été pris comme base pour la génération des listes de gènes de référence. La signification des valeurs P a été calculée avec un test hypergéométrique et le FDR a été utilisé pour la correction de tests multiples.

La collecte et le traitement d'échantillons vaginaux séquencés ont été autorisés par le Conseil régional d'examen éthique à Stockholm (n° 2017/725-31). L'approbation éthique pour les échantillons fécaux et les cultures a été levée par le comité d'examen parce que seuls des échantillons anonymisés provenant de donneurs sains ont été utilisés et qu'aucun échantillon n'a été stocké dans une biobanque. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les donneurs avant le prélèvement de l'échantillon.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage sont déposées auprès de GEO sous le numéro d'accès. GSE153497. Tous les fichiers de sortie de fivepseq générés dans cette étude sont déposés dans le référentiel de données SciLifeLab : https://doi.org/10.17044/scilifelab.22284709. Les pistes de couverture pour les échantillons vaginaux sont déposées sur https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305991. Les données sources sont déposées dans Figshare à https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955.

La version du code du programme fivepseq v.1.2.0 est disponible sur https://github.com/lilit-nersisyan/fivepseq/releases/tag/v1.2.0. Les autres scripts et fichiers de données source utilisés pour générer les chiffres sont déposés auprès de GitHub à l'adresse https://github.com/lilit-nersisyan/Atlas-of-mRNA-translation-and-decay-for-bacteria/, version v.1.0 (https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955).

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Nous remercions les membres des laboratoires Pelechano, Kutter et Friedländer et I. Piazza et V. Hauryliuk pour des discussions utiles. Nous remercions D. Omnus, J. Karlsen et F. Righetti pour leur aide, E. Loh, K. Jonas, P. Hudson, C. Condon et V. Hauryliuk pour le partage des souches bactériennes et le laboratoire d'Emmanuelle Charpentier pour la fourniture du plasmide pEC622 . Ce projet a été financé par la Fondation suédoise Starting Grant (Fondation Ragnar Söderberg), le Conseil suédois de la recherche (nos. VR 2016-01842, 2019-02335, 2020-01480 et 2021-06112), une bourse Wallenberg Academy (no. 2016.0123) , Vinnova (n° 2020-03620) et Karolinska Institutet (SciLifeLab Fellowship, fonds SFO et KI) à VP ; le programme EU H2020-MSCA-IF-2018 (sous la convention de subvention n° 845495 - TERMINATOR) et une subvention de démarrage du comité scientifique MoESCS RA (n° 21SCG-1F006) à LN ; une bourse postdoctorale RED (n° 2021, SciLifeLab-KI) à MW ; le Conseil suédois de la recherche (n° 2021-01683 et 2021-06112) à JD ; la fondation Söderbergs à LE ; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (n° PGC2018-098073-A-I00 MCIU/AEI/FEDER, UE) à JH-C. ; le National Key R&D Program of China (n° 2017YFC0908405) et la National Natural Science Foundation of China (n° 81870187) à WW ; et une bourse de chercheur avancé de l'ERC (n° 742804) au LMSVP et WW reconnaissent le soutien d'une bourse de mobilité conjointe Chine-Suède de STINT (n° CH2018-7750) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81911530167), respectivement. L'analyse informatique a été effectuée sur les ressources fournies par l'Infrastructure nationale suédoise pour l'informatique via le Centre multidisciplinaire d'Uppsala pour les sciences informatiques avancées, partiellement financé par le Conseil suédois de la recherche dans le cadre de l'accord de subvention no. 2018-05973.

Financement en libre accès fourni par l'Institut Karolinska

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Susanne Huch, Lilit Nersisyan.

SciLifeLab, Département de microbiologie, tumeur et biologie cellulaire, Karolinska Institutet, Solna, Suède

Susanne Huch, Lilit Nersisyan, Maria Ropat, Donal Barrett, Mengjun Wu et Vicent Pelechano

Institut arménien de bioinformatique, Erevan, Arménie

Lilit Nersisyan & Nelli Vardazaryan

Institut de biologie moléculaire, Académie nationale des sciences d'Arménie, Erevan, Arménie

Lilit Nersisyan & Nelli Vardazaryan

Département de microbiologie, tumeur et biologie cellulaire, Centre de recherche translationnelle sur le microbiome, Karolinska Institutet, Stockholm, Suède

Jing Wang, Valérie D. Valeriano, Juan Du et Lars Engstrand

Centre de biotechnologie et de génomique végétales, Université polytechnique de Madrid - Institut national de recherche et de technologie agricoles et alimentaires, Campus Montegancedo-UPM, Madrid, Espagne

Jaime Huerta-Cepas

Bio-Med Big Data Center, CAS Key Laboratory of Computational Biology, Shanghai Institute of Nutrition and Health, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Chine

WuWei

Stanford Genome Technology Center, Université de Stanford, Palo Alto, Californie, États-Unis

Lars M. Steinmetz

Département de génétique, École de médecine, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Lars M. Steinmetz

Laboratoire européen de biologie moléculaire, Unité de biologie des génomes, Heidelberg, Allemagne

Lars M. Steinmetz

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VP, SH et LN ont conçu et conçu l'étude. SH a effectué des travaux expérimentaux avec le soutien de DB, JW et VDVLN, SH, MR et MW ont effectué des analyses de données avec le soutien de JH-C. et DBWW et LMS ont contribué à la conceptualisation initiale et à l'interprétation des données. LE et JD ont contribué à l'interprétation des données, à la conception et à la supervision. SH, LN et VP ont rédigé le manuscrit initial et tous les auteurs l'ont révisé. VP a supervisé l'étude.

Correspondance à Vicent Pelechano.

VP, SH et LN sont cofondateurs de 3N Bio AB, qui a déposé une demande de brevet concernant une partie des travaux décrits dans ce manuscrit. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Irina Artsimovitch et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

A, Protection 3-nt spécifique au gène pour B. subtilis comme indiqué par fivepseq14. Chaque point correspond à un gène et à la proximité des limites du triangle (F0, F1 ou F2) leur cadre de protection préférentiel. Les cellules témoins NT sont représentées en vert, les intermédiaires de dégradation de l'ARNm associés aux polyribosomes en bleu, les cellules traitées par CAM en jaune et fragmentées de manière aléatoire en rouge. B, analyse métagène 5PSeq de B. subtilis après isolement de la fraction polyribosome (comme sur la Fig. 1).

AL, analyse métagène pour plusieurs espèces présentant une protection métagène 5PSeq, une transformation de Fourier rapide (FFT), une protection relative du cadre et des RNases identifiées (comme sur la figure 1).

A, NT et contrôles fragmentés des souches de type sauvage de B. subtilis (168 trpC2), ainsi que des souches knock-out rnjA, rnjB. B Souches de B. subtilis de type sauvage et mutant RNase sous choc thermique. C. Contrôle NT et échantillons fragmentés de la souche E. coli Dh5α et du TOP10 avec expression hétérologue de S. pyogenes RNJA. La préférence du motif de clivage a été calculée avec une mesure basée sur l'entropie de Shannon de la contribution des nucléotides (comme sur la figure 1C).

Graphiques linéaires montrant les pauses ribosomiques spécifiques aux acides aminés, mesurées par cinqpseq. A, pause isoleucine (Ile) (-14 nt) comparant le traitement NT et MUP chez L. plantarum, L. reuteri et B. subtilis. B, Les pauses ribosomiques spécifiques au contexte de l'alanine (Ala) et de la sérine (Ser) (-8 nt) telles que mesurées par fivepseq pour plusieurs espèces en réponse à la CAM. Seulement dans E. coli, qui manque de RNase J, le profil de dégradation du 5´P ne fournit pas d'informations sur la résolution d'un seul nucléotide du décrochage du ribosome. CD, parcelles d'analyse en composantes principales basées sur le nombre de 5P à 14 nt en amont de chaque codon pour L. plantarum et B. subtilis dans des conditions de stress. Les échantillons de contrôle NT de B. subtilis ont été collectés à différentes phases de croissance (OD600 0,2-0,3 et 0,6-0,8 respectivement). La contribution de chaque codon est représentée par des vecteurs de chargement gris. Les caractéristiques avec les chargements les plus longs correspondant à ceux avec le poids absolu le plus élevé dans le PC1 et le PC2 sont mises en évidence. Les flèches vers le haut dans les étiquettes indiquent que le nombre de 5P augmente dans des conditions de stress pour le codon. Les codons d'acides aminés communs entre L. plantarum et B. subtilis sont mis en évidence avec des couleurs spécifiques au stress. EF, pauses relatives Arg et Gln (-14 nt) dans la croissance en phase stationnaire pour L. plantarum (27 heures) et B. subtilis (8 jours).

Soit le changement de pli log2 des lectures subissant une dégradation du stress par rapport aux échantillons non traités (abondance relative) ou le changement de pli log2 de l'indice de protection du cadre (FPI) est pris en compte lors de l'exécution de l'analyse d'enrichissement. Seuls les résultats avec un taux de fausses découvertes < 0,05 sont affichés. AB subtilis et E. coli en choc thermique. BB subtilis en haute salinité. CB subtilis et L. plantarum en croissance stationnaire.

A, Barplots montrant le pourcentage (%) (axe Y) de 5' P lit chevauchant une caractéristique d'annotation génique donnée pour les souches de B. subtilis (à gauche) et d'E. coli (panneau de droite) dans des conditions normales et perturbées. Les lectures d'ARNr contaminant ont été exclues de l'analyse. B, analyse des composants principaux basée sur la taille de la bibliothèque normalisée 5' P lit sur l'échelle logarithmique naturelle du contrôle de B. subtilis et de différents renversements de RNase. Les axes représentent les composants principaux 1 et 2. C, Carte thermique montrant le changement de pli log2 dans 5' P lit l'abondance des miscRNA pour les knockouts de RNase par rapport à la souche sauvage de B. subtilis. D, comme C mais pour les 5' UTR. E, cartes thermiques montrant la couverture spécifique au brin de la taille de bibliothèque normalisée 5' P lit centré autour du site d'extrémité (TES) des 5' UTR (dans ce cas, le codon de départ) pour le contrôle de B. subtilis et différents knockouts de RNase. Chaque ligne de la carte de chaleur montre un 5' UTR. La ligne pointillée indique le site de départ des 5' UTR (c'est-à-dire les TSS). F, comme E, mais pour E. coli.

A, nombre relatif de lectures mappées de manière unique (mis à l'échelle dans chaque échantillon) en fonction de la longueur de lecture utilisée (coupée par calcul). B, analyse 5PSeq à partir d'une suspension cellulaire congelée du ZymoBIOMICS Microbial Community Standard (destiné à l'analyse de l'ADN). Les nombres de lectures attribuées à chaque espèce sont marqués dans des cercles. Protection relative du cadre et transformée de Fourier rapide (FFT), et présence/absence d'enzymes comme sur la Fig. 1. C, analyse 5PSeq à partir de microbiomes fécaux. Les nombres de lectures attribuées sont marqués dans des cercles. Exemple de périodicité de protection in vivo du ribosome 3-nt spécifique aux acides aminés (Ala) pour des espèces sélectionnées. D, idem pour le microbiome du compost.

A, Composition relative des cultures fécales utilisées en fonction de l'abondance de l'ADN génomique. B, Courbes linéaires montrant l'abondance du métagène 5PSeq par rapport à des caractéristiques sélectionnées illustrant la réponse différentielle spécifique à l'espèce en fonction de la culture d'origine. C, Exemple de Bacillota E. faecium montrant peu de réponse au traitement médicamenteux appliqué. D, les espèces de Bacteroidota, dépourvues de RNase J, présentent également des altérations claires du profil de dégradation du 5´P en réponse au traitement médicamenteux.

Fig. supplémentaires. 1 à 8, descriptions des tableaux 1 à 7 et scans non recadrés de gels.

Tableau 1 : oligonucléotides utilisés dans cette étude. Tableau 2 : résumé des échantillons et bibliothèques analysés dans cette étude. Tableau 3 : valeurs log2 (changement de pli) de l'abondance relative des lectures subissant une dégradation et des valeurs FPI pour chaque gène et analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes basée sur l'ontologie génétique dans le stress par rapport aux conditions non traitées pour B. subtilis (subsp. subtilis 168trpC2), E. coli (souche MG1655) et L. plantarum. Les valeurs d'enrichissement P ont été calculées avec un test hypergéométrique et un ajustement de test multiple effectué avec FDR et le package R WebGestaltR. Tableau 4 : effet de l'inactivation de la RNase sur l'abondance d'ARN provenant de différentes caractéristiques génomiques chez B. subtilis. Le tableau comprend le log2 (changement de facteur) pour les UTR, les TSS, les régions codantes et divers ARN et ARNt. Tableau 5 : liste de 5 804 assemblages de génomes procaryotes extraits du NCBI et utilisés pour l'alignement. Tableau 6 : liste des espèces à couverture relativement élevée identifiées dans tous les échantillons étudiés. Tableau 7 : expression estimée des RNases à l'aide de 5P-seq dans les échantillons étudiés, en RPM.

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Réimpressions et autorisations

Huch , S. , Nersisyan , L. , Ropat , M. et al. Atlas de la traduction et de la décomposition de l'ARNm pour les bactéries. Nat Microbiol 8, 1123–1136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

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Reçu : 16 juin 2022

Accepté : 19 avril 2023

Publié: 22 mai 2023

Date d'émission : juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

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